本发明专利技术公开了一种具有Cupin结构功能域的贮藏蛋白类型α-淀粉酶抑制剂的生产和纯化方法；包括(1)原核表达体系构建及菌液培养诱导表达；(2)原核表达可溶性蛋白纯化；和/或(3)原核表达包涵体蛋白纯化及蛋白复性。目前，经过多次反复实验证明，采用本发明专利技术工艺流程，对此种α‐淀粉酶抑制剂进行工艺生产，得到的蛋白产量高、纯度高，生产工艺简单方便，生产周期短，无需价格昂贵设备，是一种适合于此α‐淀粉酶抑制剂生产纯化的优良生物工艺方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工艺和食品加工领域，涉及一种具有Cupin结构功能域的IC藏蛋 白类型α-淀粉酶抑制剂的生产和纯化方法，具体涉及鹰嘴豆籽粒中贮藏蛋白类型α-淀 粉酶抑制剂的生产和纯化方法。
技术介绍
碳水化合物、脂肪和蛋白质这三种营养元素为人体提供绝大部分的能量，其中碳 水化合物提供的热量约占全部的60% -70%，如果碳水化合物摄入量过多就会转化成脂肪 囤积在机体内，过多的摄入和剩余将会引发肥胖、高血糖、糖尿病等"富贵病"。 鹰嘴豆，其籽粒尖如鹰嘴，又叫桃豆、羊头豆、诺胡提等，在我国新疆已有2500多 年的栽培历史。鹰嘴豆为维吾尔族常用药材，具有很高的药用价值，中医用于调湿止泻，解 毒消炎，强骨健胃等，此外，通过大量临床经验证明鹰嘴豆对70多种严重营养不良有明显 的疗效，因此鹰嘴豆成为开发对人类健康有益营养成分的重要植物材料。α -淀粉酶能将多 聚糖淀粉水解为单糖葡萄糖，进而作为机体吸收的能量来源，在人们生活膳食中发挥着重 要的作用。α-淀粉酶抑制剂能够有效地与人体口腔、胃肠道唾液α-淀粉酶及胰脏分泌 的α-淀粉酶结合形成酶-抑制剂的复合物，使α-淀粉酶活性丧失或降低来阻碍食物中 碳水化合物的水解和消化。基于α-淀粉酶抑制剂自身的特点，α-淀粉酶抑制剂在医学 和农业生产中有广泛的应用前景，一方面α -淀粉酶抑制剂可以作为防治和治疗高血糖、 糖尿病及高血脂等疾病的药物，另一方面也可以应用于日常生活中保健，控制饮食，减少肥 胖；同时α -淀粉酶抑制剂基因及产物对农业昆虫防治和减少杀虫剂使用、保护生态环境 有重要的应用价值。 我们前期对鹰嘴豆种子α -淀粉酶抑制剂粗提液经硫酸铵分级沉淀、离子交换色 谱和反相色谱的分离纯化后获得一个具有抑制α -淀粉酶活性的蛋白，它属于贮藏蛋白类 型（其在NCBI中编号为Q9SMJ4)，受Q9SMJ4基因控制，完全不同于已知的α -淀粉酶抑制 剂类型，是一种新的类型。该蛋白由alpha亚基（或蛋白链）和beta亚基（或蛋白链）2 个亚基组成，为蛋白前体，其在生物体内最终将剪切生成alpha链和beta链。alpha肽链和 beta肽链蛋白空间结构中各含有一个Cupin结构（如图1)。我们进一步研宄发现凡具有 Cupin结构（功能域）的蛋白普遍具有α-淀粉酶抑制活性，Cupin结构为关键的功能域。 由于鹰嘴豆籽粒中该贮藏蛋白类型α -淀粉酶抑制剂含量很少，采用天然鹰嘴豆籽粒材料 进行提取纯化，过程复杂，成本昂贵，不适于此类蛋白的提取分离和开发利用。采用生物技 术，运用合理的生物工艺流程可为鹰嘴豆中α-淀粉酶抑制剂的生产及纯化提供新途径。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种具有Cupin结构功能域的贮 藏蛋白类型α-淀粉酶抑制剂的生产和纯化方法。 本专利技术的目的可通过以下技术方案实现： -种具有Cupin结构功能域的贮藏蛋白类型α -淀粉酶抑制剂的生产和纯化方 法，包括以下步骤（1)和选自步骤（2)和步骤（3)中的一项或两项： (1)原核表达体系构建及菌液培养诱导表达： 将目的蛋白的ORF克隆至原核表达载体，并构建Q9SMJ4蛋白大肠杆菌原核表达体 系；培养Q9SMJ4蛋白大肠杆菌原核表达体系，并诱导目的蛋白表达；其中所述的原核表达 载体含有His标签蛋白编码基因； ⑵原核表达可溶性蛋白纯化： a.每50mL培养菌液收集的菌体用IOmL缓冲液1重悬菌体，，并加入150~200 μ L 35% 的 TritonX-IOO 和 50 ~100 μ L IOOmM 的 PMSF ; b.将重悬菌液置于冰上，超声破碎菌体； c.将超声破碎过的菌液离心，收集上清，弃沉淀； d.将含有His标签蛋白的上清液加入Ni柱中，控制流速0. 5-1. OmL/min，直至上 清液完全流过Ni柱； e.用6~10倍柱体积的缓冲液2冲洗Ni柱或直至A28tl值达到稳定； f.洗脱His标签表达蛋白采用梯度洗脱方式，每一梯度洗脱体积为4~5个柱体 积，收集各个梯度洗脱蛋白； g.通过SDS-PAGE电泳检测上一步中各洗脱梯度洗脱蛋白纯度，确定适合收集的 洗脱组分； h.将收集的洗脱蛋白液装入截留分子量为3600Da的透析袋中，放入超纯水中透 析20~24h除盐，期间晃动透析袋并更换超纯水； i.将透析结束的透析袋放入40% (w/v)的PEG 6000溶液中浓缩至适当体积，即 为原核表达并纯化收集的目的可溶性蛋白溶液； (3)原核表达包涵体蛋白纯化及蛋白复性： a.每50mL培养菌液收集的菌体用0.1 M磷酸缓冲液IOmL重悬菌体； b.将重悬菌液置于冰上，超声破碎菌体； c.将超声破碎过的菌液离心，收集沉淀，弃上清； d.用0. 1~0. 3M磷酸缓冲液洗涤沉淀，离心，收集沉淀； e.用IOmL溶解液溶解沉淀，在室温下孵育l_2h ; f.离心30~40min，收集上清液，弃沉淀不溶物； g.用8~10倍柱体积缓冲液3平衡Ni柱，控制流速为0. 5-1. OmL/min ; h.将步骤f中收集到的含有His标签蛋白的上清液加入Ni柱中，控制流速 0. 5-1. OmL/min，直至上清液完全流过Ni柱，上样体积：柱体积比例最大为15:1 ;i.用4~ 6倍柱体积缓冲液3再次平衡Ni柱，控制流速0. 5-1. OmL/min ; j.用2~3倍柱体积的缓冲液4冲洗Ni柱或直至A28tl值达到稳定，流速控制为 1. OmL/min ； k.用5~7倍柱体积的缓冲液5洗脱包涵体蛋白流速控制为1.0 mL/min ; I. SDS-PAGE电泳检测上一步洗脱蛋白纯度及纯化效果； m.在4°C条件下将洗脱收集到的包涵体蛋白自然复性，向溶液中慢慢加入超纯 水，使溶液中脲浓度进行梯度稀释； η.将复性结束的蛋白溶液装入截留分子量为3600Da的透析袋中，放入超纯水中 透析20~25h除盐，期间晃动透析袋并更换超纯水； 〇·将透析结束的透析袋放入40% (w/v)的PEG 6000溶液中浓缩至适当体积，即 为原核表达纯化收集并复性的目的包涵体蛋白溶液。 cupin结构是指由至少6个β-折叠片形成的桶状结构，cupin结构域由两个保守 的基本区域组成，每个区域中个含有两个β折叠二级结构，两个基本保守区域之间通过一 段可变化的环状结构相连接；一个保守区域的基本构成为G(X) 5HXH(X)mE(X)6G，另一个保 守区域基本构成为G (X) 5PXG (X) 2H(X) 3Ν，但保守区域中的氨基酸在一些cupin家族蛋白中 表现出非保守性。 所述的cupin蛋白结构域来源于高等绿色植物、芽孢杆菌、子囊菌中，含有cupin 结构域蛋白家族包括种子IlS和7S贮藏蛋白、萌发素以及多种功能性蛋白。 作为本专利技术方法的一种优选，所述的具有Cupin结构功能域的贮藏蛋白类型 α -淀粉酶抑制剂为鹰嘴豆籽粒中贮藏蛋白类型α -淀粉酶抑制剂，该抑制剂在NCBI中编 号为Q9SMJ4,命名为Q9SMJ4蛋白。所述的鹰嘴豆贮藏蛋白Q9SMJ4蛋白含有2个cupin结 构域，分别位于其α和β亚基链上。 作为本专利技术方法的一种优选，所述的（1)原核表达体系构建及菌液培养诱导表达 进一步优选包括：本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种具有Cupin结构功能域的贮藏蛋白类型α‑淀粉酶抑制剂的生产和纯化方法，其特征在于包括以下步骤(1)和选自步骤(2)和步骤(3)中的一项或两项：(1)原核表达体系构建及菌液培养诱导表达：将目的蛋白的ORF克隆至原核表达载体，并构建Q9SMJ4蛋白大肠杆菌原核表达体系；培养Q9SMJ4蛋白大肠杆菌原核表达体系，并诱导目的蛋白表达；其中所述的原核表达载体含有His标签蛋白编码基因；(2)原核表达可溶性蛋白纯化：a.每50mL培养菌液收集的菌体用10mL缓冲液1重悬菌体，，并加入150～200μL 35％的TritonX‑100和50～100μL 100mM的PMSF；b.将重悬菌液置于冰上，超声破碎菌体；c.将超声破碎过的菌液离心，收集上清，弃沉淀；d.将含有His标签蛋白的上清液加入Ni柱中，控制流速0.5‑1.0mL/min，直至上清液完全流过Ni柱；e.用6～10倍柱体积的缓冲液2冲洗Ni柱或直至A280值达到稳定；f.洗脱His标签表达蛋白采用梯度洗脱方式，每一梯度洗脱体积为4～5个柱体积，收集各个梯度洗脱蛋白；g.通过SDS‑PAGE电泳检测上一步中各洗脱梯度洗脱蛋白纯度，确定适合收集的洗脱组分；h.将收集的洗脱蛋白液装入截留分子量为3600Da的透析袋中，放入超纯水中透析20～24h除盐，期间晃动透析袋并更换超纯水；i.将透析结束的透析袋放入40％(w/v)的PEG 6000溶液中浓缩至适当体积，即为原核表达并纯化收集的目的可溶性蛋白溶液；(3)原核表达包涵体蛋白纯化及蛋白复性：a.每50mL培养菌液收集的菌体用0.1M磷酸缓冲液10mL重悬菌体；b.将重悬菌液置于冰上，超声破碎菌体；c.将超声破碎过的菌液离心，收集沉淀，弃上清；d.用0.1～0.3M磷酸缓冲液洗涤沉淀，离心，收集沉淀；e.用10mL溶解液溶解沉淀，在室温下孵育1‑2h；f.离心30～40min，收集上清液，弃沉淀不溶物；g.用8～10倍柱体积缓冲液3平衡Ni柱，控制流速为0.5‑1.0mL/min；h.将步骤f中收集到的含有His标签蛋白的上清液加入Ni柱中，控制流速0.5‑1.0mL/min，直至上清液完全流过Ni柱，上样体积:柱体积比例最大为15:1；i.用4～6倍柱体积缓冲液3再次平衡Ni柱，控制流速0.5‑1.0mL/min；j.用2～3倍柱体积的缓冲液4冲洗Ni柱或直至A280值达到稳定，流速控制为1.0mL/min；k.用5～7倍柱体积的缓冲液5洗脱包涵体蛋白流速控制为1.0mL/min；l.SDS‑PAGE电泳检测上一步洗脱蛋白纯度及纯化效果；m.在4℃条件下将洗脱收集到的包涵体蛋白自然复性，向溶液中慢慢加入超纯水，使溶液中脲浓度进行梯度稀释；n.将复兴结束的蛋白溶液装入分子量为3600Da的透析袋中，放入超纯水中透析20～25h除盐，期间晃动透析袋并更换超纯水；o.将透析结束的透析袋放入40％(w/v)的PEG 6000溶液中浓缩至适当体积，即为原核表达纯化收集并复性的目的包涵体蛋白溶液。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：麻浩，王占奎，王爽，克玉木·米吉提，王泽，顾爱星，张桦，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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