修饰的凝血因子Ⅷ制造技术

本发明专利技术涉及一种修饰的猪凝血因子ＶＩＩＩ的无Ｂ结构域的形式，和编码其的ＤＮＡ以及其治疗血友病的用途。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
对相关申请的交叉参考本申请要求美国专利申请号09/037,601，(1998年3月10日提交)的优先权，该申请是1996年6月26日提交的美国专利申请号08/670,707和1997年6月26日提交的国际申请号PCT/US97/11155的后续申请，08/670,707被授予美国专利号5,859,204。联邦研究支持的认可政府对导致本专利技术的研究通过国立卫生研究院基金编号HL46215给予过部分资助，因而对本专利技术具有权利。
技术介绍
血液凝结从血小板粘附到损伤区域受伤血管的伤口壁上开始。然后，在一系列酶调控的级联反应中，可溶性纤维蛋白原分子被凝血酶转化成不溶性的纤维束，而固定血小板形成血栓。在级联反应的每一个步骤中都有一个蛋白前体转化成的蛋白酶，切割此系列中的下一个蛋白前体。在大多数步骤中需要辅助因子。凝血因子VIII作为非活性前体在血液中循环，和von Willebrand因子非共价紧密结合。凝血因子VIII被凝血酶或Xa因子蛋白水解而活化，从而使它和vonWillebrand因子分离，并在级联反应中激活其促凝血功能。蛋白凝血因子VIIIa的活化形式是一种辅助因子，该因子能增强凝血因子IXa对凝血因子X活化催化效率达几个数量级。具有凝血因子VIII缺陷或未用凝血因子VIII治疗就具有抗凝血因子VIII抗体的人，会患失控性内出血，从而可能导致一系列严重症状，从关节炎直到早逝。严重血友病病人(在美国大约为10,000)，可用输入人凝血因子VIII来治疗，如果以足够多的次数和浓度施用该因子可恢复血液正常凝血能力。凝血因子VIII的经典定义，实际上是指存在于正常血浆中的能够纠正血友病A型患者的血浆凝血缺陷的物质。在血友病病人治疗中，抑制凝血因子VIII活性的抗体(“抑制剂”或“抑制性抗体”)的产生是一种严重并发症。对凝血因子治疗性输入的反应中，有大约20％血友病A型患者产生了自身抗体。在以前未治疗过的、患有血友病A型的病人中产生了抑制性抗体，该抑制性抗体通常在治疗一年中产生。另外，使凝血因子VIII失活的自身抗体偶尔也可在以前凝血因子VIII水平正常的人体内产生。如果抑制抗体的滴度足够低，病人可通过增加凝血因子VIII的剂量进行治疗。然而，往往抑制抗体的滴度很高，以致于不能被(大量输入)凝血因子VIII所克服。另一治疗方案是在正常止血时，用凝血因子IX复合制剂(例如，KONYNE，Proplex)或重组人凝血因子VIIIa来绕过对凝血因子VIII的需要。另外，由于猪凝血因子VIII通常比人凝血因子VIII与抑制抗体的反应性要小得多，可使用部分纯化的猪凝血因子VIII制剂(HYATEC)。许多对人凝血因子VIII产生抗体的病人已成功的用猪凝血因子VIII治疗，并长时间耐受了这种治疗。然而，猪凝血因子VIII的施用不是一种完全的解决方法，因为一些病人在一次或多次输入后，会对猪凝血因子VIII产生抑制抗体。商品化的人血浆衍生凝血因子VIII的几种不同纯度的制品可用于血友病A型的治疗。这些制品包括从许多献血者的合并血液中提取的部分纯化的凝血因子VIII，它经过对病毒加热和洗涤剂处理，但含有显著水平的抗原性蛋白；用单克隆抗体纯化的凝血因子VIII，具有更低水平的抗原性杂质和病毒污染；以及重组人凝血因子VIII，它的临床试验正在进行。不幸的是，人凝血因子VIII在生理浓度和pH时不稳定，在血液中以极低的浓度存在(0.2μg/ml血浆)，特异性凝血活性很低。人们对于病毒或其它血液携带的污染物危险的关注，限制了从猪血纯化的猪凝血因子VIII的使用。血友病病人需要每天更新凝血因子VIII来防止出血和所导致的变形性血友病关节病。然而，由于分离和纯化的困难、免疫原性、以及必须排除AIDS和肝炎感染的危险等，因子VIII的供给一直不足，并在治疗使用中产生问题。使用重组人凝血因子VIII或部分纯化的猪凝血因子VIII也不能解决所有这些问题。和常用的、商品可得的、血浆衍生凝血因子VIII有关的问题激发了研制更好的凝血因子VIII制品的显著兴趣。需要以下更强的凝血因子VIII分子每个分子能传递更多的凝血活性单位；在所选的pH和生理浓度下稳定的凝血因子VIII分子；更不易于导致抑制抗体产生的凝血因子VIII；在已产生抗人凝血因子VIII抗体的病人体内能避开免疫检测的凝血因子VIII分子。因此，本专利技术的一个目的是提供一种凝血因子VIII，它能在凝血因子VIII缺陷或具有抗凝血因子VIII抑制抗体的病人体内纠治血友病。本专利技术的另一个目的是提供治疗血友病的方法。本专利技术还有一个目的是提供在所选pH和生理浓度下稳定的凝血因子VIII。本专利技术还有另一个目的是提供比人凝血因子VIII具有更强凝血活性的凝血因子VIII。本专利技术的还有一个目的是提供产生更少的针对它的抗体的凝血因子VIII。本专利技术的还有一个目的是提供一种产生重组猪凝血因子VIII和特别修饰的猪凝血因子VIII的方法。专利技术简述由于确定了本文所列出的编码猪凝血因子VIII的全长DNA序列，使得第一次能够通过在合适的宿主细胞中表达编码猪凝血因子VIII的DNA合成了全长的猪凝血因子VIII。因此，纯化的重组猪凝血因子VIII是本专利技术的一个方面。编码猪凝血因子VIII的每个结构域及其任一片段的DNA，可以用相似方法表达。另外，全部或部分B结构域缺失的猪凝血因子VIII(无B-结构域的猪凝血因子VIII)，作为本专利技术的一部分，已通过表达编码具有B结构域一个或多个密码子缺失的猪凝血因子VIII的DNA而制得。本专利技术还提供了治疗凝血因子VIII缺陷病人的药物组合物和方法，包括施用重组猪凝血因子VIII或修饰的重组猪凝血因子VII，特别是无B结构域的猪凝血因子VIII。附图简述附附图说明图1A-1H提供了人、猪以及小鼠凝血因子VIII氨基酸序列的序列比较。专利技术详述除非另有指定或说明，本文所用的“凝血因子VIII”指来自任何动物的功能性凝血因子VIII蛋白分子。除非另有指定，本文所用的“哺乳动物凝血因子VIII”包括具有任何非人哺乳动物氨基酸序列的凝血因子VIII。“动物”，如本文所用，指猪和其它非人哺乳动物。“融合蛋白”或“融合性凝血因子VIII或其片段”，如本文所用，是一杂交基因的产物，其中一蛋白的编码序列被改变，例如，通过将它的一部分和另一不同基因的第二个蛋白编码序列在正确的阅读框中连接，使得发生连接区段的不间断转录和翻译，以产生编码该融合蛋白的杂交基因。“对应的”核酸或氨基酸或两者的序列，如本文所用，是存在于凝血因子VIII或杂交凝血因子VIII分子或其片段中任一位点上的序列，和其它动物的凝血因子VIII分子一位点的序列有相同结构和/或功能，虽然核酸或氨基酸编号可能不相同。和另一凝血因子VIII序列“对应”的DNA序列和这样的序列实质上相对应，并能和指定SEQ ID NO的序列在严格条件下杂交。和另一凝血因子VIII序列“对应”的DNA序列还包括导致凝血因子VIII或其片段表达的序列，以及除非基因密码子的冗余，能与指定SEQ ID NO杂交的序列。“独特的”氨基酸残基或序列，如本文所用，指在一种动物凝血因子VIII分子中，和其它动物的凝血因子VIII分子中的同源残基或序列不同的氨基酸序本文档来自技高网...

【技术保护点】
编码ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９列出的ＰＯＬ１２１２氨基酸序列的ＤＮＡ。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：JS洛拉，
申请(专利权)人：埃默里大学，
类型：发明
国别省市：US[美国]