本发明专利技术的制剂包含分子量为１５０ｋＤ的ＩｇＧ型多克隆免疫球蛋白，该免疫球蛋白可以通过对内皮与间充质干细胞复合体的体液免疫应答的形式获得。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及药物，即含有抗体(即，免疫球蛋白)的医疗制剂。它可以用于对由于患者机体中凝血因子vm生成不足或缺乏而导致的血友病A进行治疗。血友病A是一种遗传性疾病，其与凝血因子vm的不足或更为罕见的遗传性分子异常有关。据2003年的医学证据(Van Dame et al.， Haem叩hilia，No.l,p.94-103)，该疾病的男性发生率约为1/5000，并以 可导致严重的出血性并发症(例如关节积血、肌肉血肿等)的软组织 和关节自发性出血为特征。血友病同时伴随对病毒和细菌感染的低免疫力。并发症的严重性强烈依赖于患者血浆中的凝血因子vin的水平。正常人血浆中凝血因子VIII的浓度为150 ng/ml。根据凝血因子Vin的浓度，血友病A的严重性分为三种程度轻度，含有凝血因子VIII的正常浓度的5-25。/o; 中度，含有凝血因子VIII的正常浓度的l-4。/。；和重度，低于凝血因子vm的正常浓度的iy。。
技术介绍
己知(Nilsson I.N. Hemophilia, St. Petersburg, 1999， pl01)血友病 A的凝血因子VIII的生成不足或缺乏与多种原因相关，其中一个原因是基因抑制物对凝血因子vm的生成的强烈作用；此外，人体内凝 血因子vm生成细胞形成不足也可导致凝血因子vm的生成不足。对 血友病A采取适当的治疗的目标是灭活凝血因子vm生成的抑制物， 促进内皮细胞的祖细胞的功能，以及增加凝血因子vm的生成。然而，迄今为止还没有能影响上述过程的药物。目前，对血友病A患者的治疗采用注射供体血液的新鲜冻血浆、 冷沉淀物以及凝血因子VIII的浓縮物(Yakunina L.N. and others., The modern principles of children treatment who suffer from hemophilia. Aspects of haematology/oncology and immunopathology in pediatrics. 2004，v.3,No.2，p.l-4)。所述治疗无法达到痊愈，并可能引发大量与输 血治疗相关的并发症，主要是各种类型的肝炎。然而，补充疗法最主 要的不足在于抑制了自身凝血因子VIII的生成，结果导致患者必须持 续地定期注射上述药物。
技术实现思路
本专利技术的目的是获得能促进血友病A患者的凝血因子vm的生成 的药物。本专利技术提供了一种促进凝血因子vm的生成的制剂，该制剂含有分子量为150 kD的多克隆IgG型免疫球蛋白，该免疫球蛋白通过对内皮与间充质干细胞的抗原复合物的体液免疫应答而获得。本专利技术的制剂也可以通过对内皮与间充质干细胞的抗原复合物 的异种体液免疫应答而获得。IgG型和IgGl-IgG4亚型免疫球蛋白包含具有相同氨基酸序列的 相同的恒定区以及不同的可变区，在可变区中的差异导致主要效应子 特征的差异。作为对内皮与间充质干细胞的体液免疫应答的结果，它 们能促进内皮细胞的功能性活性，调节内皮细胞祖细胞的进化并激活 间充质干细胞。具体实施方式为了获得抗原，用生理溶液洗去含有内皮、骨内膜和骨膜间充质 细胞的供体骨髓的钻取活组织中的血细胞，机械磨碎至均质态并在生 理溶液中进行称重。以1500 r/min的速度对均匀的悬浮物进行离心。将上清液进行瞬 时冷冻，之后进行解冻，再次磨碎并以3000 r/min的速度离心。采用 双縮脲法确定上清液中的蛋白质含量，并用生理溶液将其稀释至 2.2mg/ml的浓度。将该方法获得的抗原，按lkg免疫对象2.2mg/ml注射到动物体内。 任何能够对外源蛋白质导入产生体液免疫应答的生物体均可用作免 疫对象，例如词养的有角牲畜。第一次抗原注射是在有完全弗氏佐剂 或其它免疫应答剌激物的情况下进行的。此后每间隔2-7天进行下一 次注射，使得整个免疫持续时间为20-50天。将免疫对象的血液釆集 到没有防腐剂和抗凝剂的无菌容器中。动物采血率为每公斤体重不超 过10ml。血细胞沉降和凝块形成之后，将上清液(血清)放另一个无菌瓶 中。通过脱盐作用从上清液中分离出免疫球蛋白组分，分离沉淀并将 其溶解于蒸馏水中，通过层析将组分分开。用特定的柱流出物洗掉对 应于IgG型的组分，通过选择透性膜透析进行提纯。通过过滤对纯化 溶液进行除菌，按剂量分装，并在真空或惰性气体环境中干燥至含水 量为2-5%。密封安瓿。每安瓿含有一剂量本专利技术的制剂。将制剂于4。C 避光保存不超过24个月。来自健康供体的钻取活组织的骨髓的骨膜、骨内膜和间质，可以 用作人内皮与间充质干细胞的抗原材料的来源。所获得的含有内皮与 间充质干细胞的抗原可在获得后立即使用或冷冻保存直至使用。具体实施方式以下，通过对本专利技术的制剂的制备以及体外和体内应用的实例对 本专利技术进行阐明。实施例对一只25kg重的健康山羊进行免疫接种。在它身上四个不同的地 方各注射乳化于完全弗氏佐剂中55mg抗原。14天后，以2-4天的间隔， 经肠胃外注射不含佐剂的相同量的抗原6次。抗原剂量累计1.54g。从第四次注射开始，在每次注射前检査内皮与间充质细胞的抗体 (免疫球蛋白)滴度。在第五次注射前，抗体的滴度为1:512;在第六 次注射前为1:1024;在血液采集前为1:2048。最后一次抗原注射后的7 天中，从山羊的颈静脉中采集250ml不含防腐剂的血液。以3000r/min的速度离心30分钟，从凝块和血细胞中分离出血清。 通过添加硫酸氨饱和溶液，使多种球蛋白组分从血清中沉降出来。通 过离心分离上清液，将沉淀物溶解于蒸馏水中，蛋白质浓度为5mg/ml。 将溶液注入层析柱中，分离免疫球蛋白IgG组分后用0.025M tris-HCE (pH7.8)-0.15Mtris-HCE(pH7.8)的缓冲液进行洗脱。通过选择透性 膜向蒸馏水中对溶液透析2天。透析后，将免疫球蛋白溶液用直径为 0.22微米的微孔滤器进行过滤灭菌。将液体无菌溶液以lml分装在安 瓿中。每剂量中的蛋白质含量为5mg。通过冻干使之干燥，即在-60。C 至37。C的条件下冻干免疫球蛋白。密封安瓿。将制剂保存于4T的温 度直至使用。在成品制剂中抗原对内皮与间充质细胞抗原的滴度为1:1200。剩 余含水量为总量的3%。冻干的制剂为白色、多孔、吸湿性物质，其 在室温下60秒内可完全溶解于水或生理溶液中。将每安瓿中的物质 溶解于lml水中，所得溶液为透明、略带乳白色的溶液。按照常规技术，检测制剂的无菌性、毒性和无热原状态。在本发 明的制剂集中作用于血细胞的条件下，通过各检测中该制剂引起血细 胞凝集和血小板凝聚作用的能力，以及通过Terasky的方法(Ketlinskii S.A.， Kalinina N.M. Immunology for doctor. Saint-Petersburg, 1998， p156)在微淋巴细胞毒性检测中该制剂引起淋巴毒性的能力，确定了其特殊的无害性。在所检测的稀释度下，本专利技术的制剂不具有毒性。在光学和电子 显微镜下进行形态学检查，没有发现细胞质空泡化和结构破裂的毒性 特征；用标准染料显色，结果显示细胞器完整无损坏。将本专利技术的制剂在重度血友病A患者上进行检测。选择14岁的患 者G、 22岁的患者本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种促进凝血因子Ⅷ的生成的制剂，其含有分子量为１５０ｋＤ的多克隆ＩｇＧ型免疫球蛋白，所述免疫球蛋白通过对内皮与间充质干细胞的抗原复合物的体液免疫应答而获得。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：EA谢利瓦诺夫，VA贡恰里，VN克拉韦茨，VI鲁盖尔，
申请(专利权)人：AV比兹亚夫，
类型：发明
国别省市：RU[]
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