一种从转基因牛乳中纯化重组人乳铁蛋白的方法技术

本发明专利技术提供了一种从转基因牛乳中纯化重组人乳铁蛋白的方法，该方法首先制得去除乳脂和酪蛋白的乳清，然后用阳离子交换色谱进行纯化，并用０．４－１Ｍ　　ＮａＣｌ、２０ｍＭ　　Ｎａ↓［３］ＰＯ↓［４］梯度洗脱，最后对洗脱液进行超滤或透析处理得到高纯度的重组人乳铁蛋白。采用本发明专利技术所述方法得到的重组人乳铁蛋白纯度高达９５％以上，具有和天然人乳铁蛋白相似的抵抗胰蛋白酶消化和结合铁离子的能力，而且纯化成本低，适合工业化规模生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体地涉及一种从转基因牛乳中纯化重组人 乳铁蛋白的方法。
技术介绍
人乳铁蛋白(Human lactoferrin， HLF )是一种属于铁结合蛋白家族的糖 基化蛋白，由Sorensen首次发现，并由Blanc和Isliker命名。一系列研究表明乳铁蛋白具有多种重要的生理功能(1)乳铁蛋白在结 构上和生物化学特征上与转铁蛋白的高度相似性表明，乳铁蛋白作为铁转移 分子在铁代谢中可能起着很重要的作用；(2)乳铁蛋白通过各种不同的机制 实现其抗菌作用，它是一种铁结合蛋白，能限制可利用自由铁的含量，而铁 是微生物生长所必须的一种生长因子，故能抑制细菌生长，此外它还可以破 坏革兰氏阴性细菌的外膜，释放抗菌活性肽；(3)乳铁蛋白具有非常强的抑 制各种具有包膜的病毒侵染的能力，如人细胞巨化病毒、HIV、简单疱麥病 毒和人的丙型肝炎病毒等；(4)乳铁蛋白能调节炎症反应；(5)乳铁蛋白可 以通过络合铁离子来降低含氧自由基对细胞的损害；(6)乳铁蛋白还具有抗 癌作用；(7)乳铁蛋白对免疫系统的作用非常广泛，它对抗体生成、T细胞 成熟等都有一定的调控作用；(8)乳铁蛋白除了上述功能之外，还有一些其 他的功能，如RNA酶活性、蛋白酶活性、转录调控功能等。在过去的二十年时间里，人乳铁蛋白转基因研究已取得了很大进展。一 些成功的转基因系统可得到较高表达量的重组人乳铁蛋白(高于l克/升)。 重组人乳铁蛋白的许多属性都与人乳铁蛋白相同。关于从乳中纯化乳铁蛋白方法的专利比较多，例如美国专利US 4,436,658描述了从脱脂和去除了酪蛋白的乳清中纯化牛乳铁蛋白的方法，采 用pH7.7-8.8的微碱性介质，让乳清通过硅胶颗粒，然后用0.5MMaCl/0.1N乙 酸洗脱，得到乳铁蛋白。美国专利US4,791，193和欧洲专利No.EP.0 253 395(Okonogi等)报道了相似的方法，采用偶联了羟甲基的弱酸性阳离子交换 树脂，吸附的乳铁蛋白用10。/。NaCl梯度洗脱。美国专利US4,668,771釆用单 克隆抗体纯化牛的乳铁蛋白。而专利W089/04608则描述了一种从牛的乳清 中获得牛乳过氧化物酶和乳铁蛋白的方法，用滤过的牛乳清通过强阳离子交 换剂，在pH〈6.0条件下，采用较高的流速，选择性吸附牛乳过氧化物酶和乳 铁蛋白，然后用0.5-2.0MNaCl溶液洗脱。美国专利US4,997,914描述了 一种 从人初乳或生鲜乳中纯化人乳铁蛋白的方法，釆用交联多糖的硫酯吸附人乳 铁蛋白，然后0.4-1.5MNaCl溶液洗脱。中国专利CN03152940.2描述了从牛 初乳中分离牛乳铁蛋白的方法，釆用肝素一琼脂糖(Heparin-Sepharose CL-6B) 亲和层析柱，用缓冲液(0~ 1MNaCl， pH6.5~8.5， 0.05 ~ 0.005摩尔磷酸钾) 洗脱。中国专利CN200410016117.5描述了一种从牛初乳、牛奶或乳浆中提取 乳铁蛋白和乳过氧化物酶的方法，应用阳离子交换树脂吸附乳铁蛋白和乳过 氧化物酶，用高渗离子渗透液洗脱吸附的乳铁蛋白和乳过氧化物酶，低浓度 的缓冲液(02-0.5MNaCl)洗脱乳过氧化物酶，高浓度的缓冲液(2.5MNaCl) 洗脱乳铁蛋白，中浓度的缓冲液(>0.7MNaCl)同时洗脱乳铁蛋白和乳过氧 化物酶。中国专利CN200410080264.9将活化的羟甲基弱酸性阳离子交换树脂 与脱脂初乳(或初乳乳清)混合，在0-5(TC范围内，轻轻搅拌2-20h，用滤布将 树脂分离，用去离子水洗脱树脂来除去杂蛋白，然后用0.1%-15%的盐溶液 (NaCl, KC1， CaCl2， MgCl2, Na2C03等)洗脱树脂，得到乳铁蛋白。美国专 利US 5,849,885采用Mono S琼脂糖或S Sepharose， 20mM磷酸钠缓冲液， 0-1M NaCl溶液梯度洗脱，从转基因牛乳中纯化人乳铁蛋白。美国专利 5,861,491则釆用疏水相互作用色谱，从人和牛乳铁蛋白混合物中分离人乳铁 蛋白。Querinjean等(1971)釆用CM Sephadex C-50从人乳中纯化人乳铁蛋白， 用0.33MNaCl洗脱。Johannson(1969)釆用CM Sephadex C-50,并且报道了使 用磷酸钙缓冲液。Torres(1979)报道从豚鼠乳中纯化乳铁蛋白，预先脱脂和去 酪蛋白，釆用Whatman CM-52，0.5MNaCl/5mM磷酸钠，pH7.5,洗脱。Roberts 和Boursnell (1975)报道了从猪乳中纯化乳铁蛋白的方法，釆用CM-Sephadex柱子，0.5M NaCl/20mM磷酸盐(pH7)洗脱，然后又上CM-Sephadex,用 0.4MNaCl洗脱。Zagulski(1979)釆用CM-SephadexC國50， 0.5M NaCl/0.02M 磷酸钠(pH7)洗脱，从脱脂牛乳中纯化乳铁蛋白。Moguilevsky(1975)采用 CM-Sephadex， 1M NaCl洗脱，从人乳中纯化乳铁蛋白。Ekstrand和Bjorck(1986)报道了从牛乳或人初乳中纯化乳铁蛋白的方法，脱脂的乳汁酸化，再调 pH = 7.8，上Mono S柱，然后用线性NaCl浓度梯度洗脱。Foley和Bates (1987) 报道了从人初乳乳清中分离乳铁蛋白，乳清与弱离子交换树脂(磷酸纤维素) 混勻，然后用stepped盐浓度和pH梯度(0.25M NaCl/0.2M sodium phosphate ) 洗脱。Yoshida和Ye-Xiuyun (1991)采用羧甲基阳离子交换树脂分离乳铁蛋 白，0.05M磷酸盐缓冲液(pH7.7),线性梯度(0-0.55M NaCl)洗脱。羧甲 基Toyopeari柱子只结合牛乳清中的乳铁蛋白和乳过氧化物酶，然后用 0.4-0.55M NaCl洗脱，得到乳铁蛋白A和乳铁蛋白B。此外，还有报道采用 亲和层析的方法，例如Kawakami(1987)报道釆用人或牛乳铁蛋白的单克隆抗 体纯化乳铁蛋白，Hutchens(1989)采用单链DNA亲和柱从母乳喂养婴儿的尿 中分离乳铁蛋白。Chen和Wang (1991)釆用亲和层析和过滤结合的方法从牛 奶酪中纯化乳铁蛋白，他们使用肝素-琼脂糖结合乳铁蛋白，Bezwoda等(1986) 报道Cibacron Blue F3GA树脂纯化乳铁蛋白的方法。对于从牛乳铁蛋白中纯 化人乳铁蛋白的方法并未见报道。综上所述，纯化人乳铁蛋白的方法主要有吸附色谱法、离子交换色谱法、 亲和色谱法、超滤和盐析法，这些方法在应用上都存在一定的局限性，例如 吸附色谱法操作简单，但吸附容量小、效率低；亲和色谱法的优点是分离效 果好、纯度高，但柱的制备工艺复杂，成本昂贵；而超滤和盐析法不能实现 规模化生产。随着转基因大家畜的成功，从这些转基因大动物的乳中规模化生产人乳 铁蛋白已经成为可能。本专利技术针对现有技术的空白，建立了从转基因牛乳中 分离有生物活性的重组人乳铁蛋白的方法。
技术实现思路
(一)要解决的技术问题本专利技术的目的是提供一种经济高效的从转基因牛乳中纯化重组人乳铁蛋 白的方法，并且使纯化的目的蛋白具有本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从转基因牛乳中纯化重组人乳铁蛋白的方法，其特征在于它包括如下步骤：（１）制备乳清：将转基因牛乳离心去除乳脂，然后调节ｐＨ值去除酪蛋白，得到备用乳清；（２）用阳离子交换色谱进行纯化，并用０．４－１ＭＮａＣｌ、２０ｍＭＮａ↓［３］ＰＯ↓［４］梯度洗脱，收集合并同一峰值的洗脱液；（３）对洗脱液进行超滤或透析处理，制得高纯度的重组人乳铁蛋白。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李宁，汤波，杨鹏华，王建武，
申请(专利权)人：北京济普霖生物技术有限公司，李宁，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]