一种从转基因牛乳中纯化重组人α－乳清白蛋白的方法技术

本发明专利技术提供了一种从转基因牛乳中纯化重组人α－乳清白蛋白的方法，它采用了两步液相色谱分离纯化法。该方法可以有效的将转基因牛乳中表达的重组人α－乳清白蛋白与牛乳中的其它蛋白分离，避免了牛内源性α－乳清白蛋白的污染，得到的目的蛋白纯度达到９９．９％以上。将该方法按比例放大，可用于工业化生产。采用本发明专利技术所述方法得到的重组人α－乳清白蛋白，保持了α－乳清白蛋白完整的生物活性。而且整个纯化过程中所使用的缓冲液成分简单，有效降低了纯化成本，并减少了废液对环境的污染。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体地涉及一种从转基因牛乳中纯化重组人 a-乳清白蛋白的方法。
技术介绍
a-乳清白蛋白是哺乳动物乳腺中特异表达的一种蛋白，其主要生理功能 是改变卩-l,4-半乳糖苷转移酶的底物特异性，促进乳糖的合成，从而调节乳中 的渗透压。oi-乳清白蛋白具有较高的营养价值，含有人体营养所需要的各种 必须氨基酸(必须氨基酸的含量占氨基酸组成的63%)，其中半胱氨酸、色氨 酸、异亮氨酸和亮氨酸含量丰富。半胱氨酸是体内抗氧化剂谷胱酐肽的一种 前体，有利于体内自由基的清除；色氨酸是神经递质5-羟色胺的合成前体，可以促进婴儿的神经发育和改善睡眠质量；异亮氨酸和亮氨酸属于支链氨基 酸，能促进肌肉中蛋白质的合成。同时，来源于人(x-乳清白蛋白的生物活性 肽，具有抑菌功效，并能提高机体的免疫力。因而a-乳清白蛋白成为配方奶 粉和各种功能性食品的主要原料。近年来的研究发现，人a-乳清白蛋白多聚 体或结构变异体能够抑制多种肿瘤细胞的增殖，诱导其凋亡，是一种潜在的 新型抗肿瘤药物，临床试验表明人a-乳清白蛋白结构变异体可以有效地治疗 乳头瘤状病毒感染导致的皮肤疣。鉴于人ct-乳清白蛋白的重要性，需要获得大量高纯度的人ct-乳清白蛋白 以进行功能研究，并满足功能性食品和临床药物开发的需要。从人乳中获得 这种蛋白远远不能满足需求。牛乳腺是天然的大型生物反应器，利用转基因 克隆技术，在牛乳腺中重组表达具有生物活性的转基因人a-乳清白蛋白成为 理想的选择。由于牛乳中含有内源的a-乳清白蛋白，为重组蛋白的后继纯化带来挑战。 目前，用于分离、纯化天然的a-乳清白蛋白的方法可分为三类'.根据蛋白质 的理化特性进行选择性沉淀；利用蛋白质的分子大小进行膜过滤；与特定介质的选择性吸附和洗脱。前两类方法只能对牛乳中的蛋白质进行粗分离，且回收率低，不能获得高纯度的a-乳清白蛋白。第三类是比较常用的分离乳中特定蛋白质的方法，主要包括亲合层析、离子交换色谱、凝胶过滤色谱、疏 水互作色谱等。用亲合层析纯化ct-乳清白蛋白，主要是利用a-乳清白蛋白的钙离子结合特性，选择性吸附乳中钙离子结合蛋白，配合凝胶过滤层析，能够提高蛋白的纯度；阴离子交换色谱纯化a-乳清白蛋白是当前较为常用的蛋白纯化技术， 具有纯化成本低、色谱柱载样量不受样品体积限制、纯化工艺容易放大等优 点；疏水互作色谱需要使用有机溶剂进行洗脱，易使目的蛋白质变性，失去 生物活性，因而很少采用。转基因牛乳中表达的重组人a-乳清白蛋白和牛a-乳清白蛋白具有相似的 理化特征，例如相近的分子量(人a-乳清白蛋白为14,070 Da,牛a-乳清白蛋 白为14,178 Da)和相似的等电点(pH4.2-4.6),目前的纯化方法不能有效 的将二者分离。要获得高纯度的重组人a-乳清白蛋白，就必须对现有的纯化 方法进行优化。
技术实现思路
(一) 要解决的技术问题本专利技术的目的是提供一种从转基因牛乳中纯化重组人a-乳清白蛋白的方法。(二) 技术方案本专利技术提供了一种从转基因牛乳中纯化重组人a-乳清白蛋白的方法，它 包括如下步骤(1) 用超速离心沉淀转基因牛乳中的酪蛋白，并脱脂，获得含有重组人 a-乳清白蛋白的乳清；(2) 将获得的乳清用50 mM Tris-HCl稀释平衡，采用阴离子交换色谱 进行第一步纯化先用50mMTris-HCl的缓冲液将没有与色谱柱上的载体介质结合的蛋白质洗脱，再用50 mM Tris-HCl + 1 MNaCl的缓冲液进行分步梯 度洗脱，分步梯度洗脱的操作为先用50 mM Tris-HCl + 0.05 MNaCl直接洗 脱，再用50 mM Tris-HCl+ 0.05-0.4 M的NaCl梯度洗脱。收集各个洗脱峰， 采用15%的Native-PAGE电泳法(具体操作参见《分子克隆》第三版，科学 出版社，2002年8月出版)检测重组人a-乳清白蛋白，结果分步梯度洗脱时 用50 mM Tris-HCl + 0.05 M NaCl直接洗脱得到的洗脱峰组分中含有重组人 a-乳清白蛋白，而用50 mM Tris-HCl + 0.05-0.4 M的NaCl梯度洗脱得到的洗 脱峰组分中含有转基因牛乳的内源cx-乳清白蛋白和(3-乳球蛋白。本步的原理是根据多次蛋白纯化条件的摸索，发现在pH值接近中性 的缓冲液中，重组人a-乳清白蛋白和牛a-乳清白蛋白与阴离子交换介质结合 能力存在一定的差别，用低离子浓度NaCl可以先将重组人a-乳清白蛋白从 色谱柱上洗脱，从而与内源a-乳清白蛋白分离。(3)收集含有重组人a-乳清白蛋白的组分，浓缩，釆用凝胶过滤色谱进 行第二步纯化首先用50 mM Tris-HCl + 0.1 M NaCl缓冲液平衡凝胶过滤色 谱柱，再用50 mM Tris-HCl+ 0.1 MNaCl作为洗脱缓冲液进行洗脱，收集各 个洗脱峰，采用15%的Native-PAGE电泳法检测组分为重组人a-乳清白蛋白 的洗脱峰，从而得到纯化的重组人a-乳清白蛋白。本步的原理是采用凝胶过滤色谱根据蛋白质的分子大小分离各种蛋白成分。在本专利技术所述的方法中，步骤(2)中洗脱的流速是60cm/h,步骤(3) 中洗脱的流速是30 cm/h。所用的Tris-HCl缓冲液的pH均是7.4。 本专利技术所述的方法可以用于从转基因家畜乳中分离转基因蛋白。 (三)有益效果本专利技术提供的从转基因牛乳中纯化重组人a-乳清白蛋白的方法，采用了 两步液相色谱分离纯化法，可以有效的将转基因牛乳中表达的重组人a-乳清 白蛋白与牛乳中的其它蛋白分离，避免了牛内源性(x-乳清白蛋白的污染，得 到的目的蛋白纯度达到99.9%以上。将该方法按比例放大，可用于工业化生 产。采用本专利技术所述方法得到的重组人a-乳清白蛋白，保持了 a-乳清白蛋白 完整的生物活性，具有与天然的人a-乳清白蛋白相似的空间结构。不仅如此，由于在整个纯化过程中所使用的缓冲液成分简单，避免了大 量盐分的使用，从而有效降低了纯化成本，并减少了废液对环境的污染。附图说明图l是转基因牛乳中重组人a-乳清白蛋白阴离子交换纯化色谱图，其中 箭头表示含有重组人a-乳清白蛋白的色谱峰；图2是15%Native-PAGE检测阴离子交换色谱纯化结果，其中方框内表 示含有重组人a-乳清白蛋白分离组分的电泳结果；图3是转基因牛乳中重组人a-乳清白蛋白凝胶过滤纯化色谱图，其中箭 头表示重组人a-乳清白蛋白色谱分离峰；图4是15。/。Native-PAGE检测凝胶过滤色谱纯化结果，其中椭圆内所示 纯化后的重组人a-乳清白蛋白；图5是纯化的重组人a-乳清白蛋白15% Native-PAGE和Westem-Blot检 测图6是15。/。SDS-PAGESYPRORuby蛋白染色检测重组人a-乳清白蛋白 纯度，其中，Sl、 S2、 S3代表纯化的重组人(x-乳清白蛋白，并以人天然cc-乳清白蛋白作为阳性对照，whey为转基因牛乳清；图7是重组人oc-乳清白蛋白结合钙离子的电泳迁移率图，其中，从左往 右数，泳道3-8代表重组人a-乳清白蛋白，泳道l、 2代表人天然的a-乳清白 蛋白，9、 10为牛a-乳清白蛋白对照；图8是重组人(x-乳清白蛋白合成乳糖能力检测结果图，其中，XW、 LW、 HW代表重本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从转基因牛乳中纯化重组人α－乳清白蛋白的方法，其特征在于它包括如下步骤：（１）用超速离心沉淀转基因牛乳中的酪蛋白，并脱脂，获得含有重组人α－乳清白蛋白的乳清；（２）将获得的乳清用５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ稀释平衡，采用阴离子交换色谱进行第一步纯化：先用５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ的缓冲液将没有与色谱柱上的载体介质结合的蛋白质洗脱，再用５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ＋１ＭＮａＣｌ的缓冲液进行分步梯度洗脱，收集各个洗脱峰，检测重组人α－乳清白蛋白；（３）收集含有重组人α－乳清白蛋白的组分，浓缩，采用凝胶过滤色谱进行第二步纯化：首先用５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ＋０．１ＭＮａＣｌ缓冲液平衡凝胶过滤色谱柱，再用５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ＋０．１ＭＮａＣｌ作为洗脱缓冲液进行洗脱，收集各个洗脱峰，检测重组人α－乳清白蛋白，得到纯化的重组人α－乳清白蛋白。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李宁，汤波，王建武，杨鹏华，
申请(专利权)人：北京济普霖生物技术有限公司，李宁，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]