重组蛋白质的衍生物、粒细胞集落刺激因子的同多聚体及其制备方法技术

本发明专利技术涉及重组蛋白质的衍生物(包含基因融合的重组生物活性蛋白质单体单元经选定接头部分连接的同多聚体)及其制备方法。重组蛋白质的衍生物优选是人粒细胞集落刺激因子的二聚体，特征在于体内循环时间增加。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术涉及重组蛋白质的衍生物(包含基因融合的重组生物活性蛋白质单体单元经选定接头部分连接的同多聚体)及其制备方法。重组蛋白质的衍生物优选是人粒细胞集落刺激因子的二聚体，特征在于体内循环时间增加。【专利说明】重组蛋白质的衍生物、粒细胞集落刺激因子的同多聚体及其制备方法
本专利技术属于蛋白质生物
，实际上，本专利技术提供了增加有治疗价值之重组蛋白质体内循环时间之难题的一个解决方案。更具体地，本专利技术涉及制备具有经延长循环半衰期之干扰素a -2a或粒细胞集落刺激因子的基因融合的同多聚体，所述多聚体包含至少两个通过限定长度的接头遗传连接的蛋白质单体单元，和有效地分离和纯化所产生的生物活性G-CSF 二聚体。本专利技术还涉及用于在宿主细胞中表达的合成基因，所述合成基因编码含有在G-CSF单体单元之间限定长度之接头的人G-CSF 二聚体形式。
技术介绍
在本申请中，术语“有治疗价值的蛋白质”指适用于治疗并通过遗传工程产生的有药理活性的蛋白质，包括哺乳动物抗体、血液产品替代物、疫苗、激素、细胞因子。潜在的治疗性蛋白质与传统的新药物实体(其一般为低分子量的生物活性化合物)在许多重要方面不同。为了有效，蛋白质药物在与其天然形式显著不同的环境中以与其天然形式显著不同的浓度使用，并且这可导致体内不良反应。为了避免毒性或使其最小化并增加有效性，通常通过一些形式的蛋白质修饰(例如与其他大分子共价缀合、抗体结合、诱变和糖基化)来改变蛋白质的物理化学性质和生物学性质。术语“生物活性蛋白质”指表现出与各自天然蛋白质相同的可检测生物活性的蛋白质分子。术语“单体单元”指天然发生的生物活性之蛋白质的单一多肽链。术语“同多聚体”`指由多于一个的相同生物活性的多肽亚单位组成的线性多肽链，其通过肽接头分子以通过二硫键连接多肽亚单位以外的方式相互连接。术语“基因融合”指使用如下重组DNA方法学获得同多聚体蛋白质:构建由两个或更多个通过接头DNA序列连接的单体蛋白质的基因(编码序列)组成的人工DNA片段，将所述DNA片段引入载体并在所选择的细胞类型中表达蛋白质。重组蛋白质由与接头肽序列相连的单体蛋白质(可在进行特定纯化过程后分离的蛋白质)组成，不同于通过使用特定化学方法连接两个或更多个单体蛋白质儿获得的“化学缀合”蛋白质以及通过单体蛋白质使用化学试剂或聚合物残基对单体蛋白质进行化学修饰而获得的“化学修饰”蛋白质。在过去的二十五年中，生物化学、蛋白质化学和分子生物学的进展促使重组蛋白作为可注射治疗剂的使用增加和发展。自从1982年批准第一个重组产品胰岛素以来，蛋白质和肽生物药物已被成功地用作在治疗多种病生理状态中非常有效的药物。一组已被批准的第一代蛋白质生物药物模拟天然蛋白质并用作替代治疗，而另一组则呈递单克隆抗体用于将拮抗剂治疗或活化有功能故障的机体蛋白质。第一代生物药物的主要缺点为:其非最佳的物理化学、药代动力学和药效动力学(PK/PD)特性。主要限制为物理化学不稳定性、有限的溶解度、蛋白水解稳定性差、相对短的消除半衰期、免疫原性和毒性。因此，蛋白质治疗主要为肠胃外施用。在过去十年间，已经开发出了针对第二代生物药物发展的多种技术，包括通过赋予第一代蛋白质药物的主要产品以改进的ρκ/ro特征。体内循环半衰期的延长是这些治疗的主要目标。长效形式的促红细胞生成素(ΕΡ0，包含两个N连接的寡糖链，名称为Aranesp)粒细胞集落刺激因子(PEG化的G-CSF，名称为Neulasta)和干扰素(PEG化的IFN a -2b (名称为PEG-1ntron)或PEG化的IFN a -2a (名称为Pegasys))是第二代生物药物的成功实例，其获得了 “重磅炸弹”的地位。一种广泛使用的延长目标治疗蛋白质之血浆半衰期的方法是化学修饰，其关注通过使用以下公知的已充分建立的方法通过与天然或合成聚合物缀合来增加治疗蛋白质的大小，所述方法例如聚乙二醇化(与聚乙二醇化学缀合，Veronese F.Μ.等，ProteinPEGylation, basic science and biological application in PEGylated ProteinDrugs:Basic Science and Clinical Applications, ed.F.M.Veronese,11-31(2009)) >聚唾液酸化(与聚唾液酸化学缀合，Sanjay Jain等，Polysialylation:The natural wayto improve the stability and pharmacokinetics of protein and peptide drugs,dds&s第4卷五月第I期(2004))，羟乙基淀粉化(与羟乙基淀粉化学缀合，国际专利申请W002/080979和国际专利申请TO03/000738)等。对治疗蛋白质之清除进行修饰的另一方法是通过化学交联或遗传修饰将目的融合蛋白质与长寿命的血浆蛋白质(如白蛋白、免疫球蛋白、或这些蛋白质的一部分)融合(Sheffield,Modification of clearance of therapeutic and potentially therapeuticproteins, Curr.Drug Targets Cardiovasc Haematol Disord., 1,1-22.(2001))。对治疗蛋白质之N或C末端进行修饰或者将已知易受酶切割影响的氨基酸进行替代，也用作降低免疫原性和蛋白水解不稳定性的策略并由此改进血浆半衰期(Werle M和Bernkop-Schmurrch, Amino acids,30,351-367(2006))。然而，所有这些修饰常导致目的蛋白质生物活性的显著降低或导致抗体形成。由于这些原因，具有改进的血浆半衰期的蛋白质在临床应用中的范围相对受到限制。因此，探索改变治疗蛋白质之循环半衰期的新方法保仍然是当前生物技术的一项挑战性任务。专利US5580853描述了制备包含经两个或更多个硫醚键共价连接在一起的两个或更多个促红细胞生成素分子的多聚体促红细胞生成素衍生物。这些促红细胞生成素多聚体表现出提高的生物学活性和延长的循环时间。在该方法中，通过使野生型促红细胞生成素与含有可切割二硫键基团的异型双功能交联剂进行化学反应生成第一促红细胞生成素衍生物。将二硫键还原以产生含有游离巯基的促红细胞生成素。通过使野生型促红细胞生成素与含有马来酰亚胺基的异型双功能交联剂进行化学反应生成第二促红细胞生成素衍生物。所述第一与第二促红细胞生成素衍生物在一起反应，由此形成在巯基和马来酰亚胺基之间的至少一个硫醚键，从而形成促红细胞生成素的同二聚体或同三聚体。这些多聚体促红细胞生成素分子表现出与野生型促红细胞生成素可比的生物活性并且相对于野生型促红细胞生成素的延长的体内循环半衰期。然而，蛋白质分子的化学缀合(例如促红细胞生成素形成多聚体形式)可伴有通过参与受体结合之氨基酸残基的官能团进行非特异性化学修饰。这可降低多聚体产物的生物活性。一般来讲，化学修饰可产生不适当连接的产物，其必须与正确连接的目标产物和其他副产物分离。这样的修饰过程是昂贵的，并且需要额外本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组蛋白质衍生物，其包含基因融合的重组生物活性蛋白质单体单元的同多聚体，所述单体单元通过合适的肽接头部分连接，其中蛋白质单体单元具有天然生物活性蛋白质的氨基酸序列或具有至少95％同一性的基本上相同的序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：埃迪塔·米斯蒂涅内，乔纳斯·亨利卡斯·佩斯利亚卡斯，米尔达·普莱凯蒂特，金陶塔斯·兹维布利斯，
申请(专利权)人：普罗法尔马封闭式股份公司，
类型：发明
国别省市：立陶宛;LT