本发明专利技术提供了用于检测多肽聚集的调控物的多肽聚集筛选测定法，它能够为与多肽聚集有关的病理学状态提供新的疗法，尤其是阿耳茨海默氏病。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及对在许多人类疾病状态中观察到的多肽聚集的调控物进行检测的方法。
技术介绍
影响人群的许多严重疾病可能与不正确的多肽片段聚集密切相关，其特征为聚集体在损伤或斑块处沉积，常常导致斑块部位的异常生理学功能。例如，已经提出特定蛋白质中一段聚谷氨酰胺重复片段是许多神经学紊乱的起因，包括亨廷顿氏病和脊髓延髓性肌萎缩，而提出其它无关蛋白质聚集是朊病毒疾病(PrP聚集)、帕金森氏病和肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)(α-共核素(α-synuclein)聚集)、透析相关淀粉样变(β-2微球蛋白聚集)、角膜营养不良(角质-上皮沉积)的起因，另外在超过95％的II型糖尿病中有胰岛淀粉状蛋白多肽聚集。特别感兴趣的是阿耳茨海默氏病中β-淀粉状蛋白多肽的聚集。阿耳茨海默氏病(AD)是神经退化性紊乱，其特征为与淀粉状蛋白斑块形成、神经纤维缠结、和相关神经元毒性有关的认知功能逐渐下降和记忆丧失。据信阿耳茨海默氏病的开始和发作既具有遗传起源又具有偶发的环境影响发作(Davies P.，Annals of the N.Y.Acad.ofSci.，9248-16，2000)。至今已经鉴定了与家族性发作AD有关的几处遗传突变。已经在淀粉状蛋白前体蛋白(amyloid precusor protein，APP)自身以及早老素-1或早老素-2基因中发现了显著参与AD发作的突变。然而，所有这些突变中的共同点是形成由称为淀粉状蛋白贝塔(Aβ)的APP分子切割片段衍生的蛋白质或老年斑，APP在患病个体的大脑中沉积，并导致神经元细胞毒性和死亡。在与AD非直接相关的另一种遗传缺陷，即与唐氏综合症有关的21号染色体三体性中，也可以检测到这种斑块形成现象。淀粉状蛋白前体蛋白(APP)是具有大型胞质结构域和较短胞内C端区域的单一跨膜糖蛋白，天然存在几种剪接形式，它们或是751个氨基酸(Ponte等人，Nature，331525-527，1988；Tanzi等人，Nature，331528-530，1988)，或是695个氨基酸(Kang等人，Nature，325733-736，1987)，称为“正常”APP。APP695变体在神经元中更加广泛表达。淀粉状蛋白前体蛋白切割是通过由α、β、和γ分泌酶(secretase)介导的一系列酶促反应进行的。α-分泌酶在APP770的大约第687位残基处切割APP跨膜结构域N端约12个残基，产生大型可溶性蛋白质s-APPα(它是非致病性的)以及83个氨基酸的C端片段。γ-分泌酶在C末端第711或712位氨基酸之后切割，产生称为p3的游离肽。或者，可以由β-分泌酶(天冬氨酰蛋白酶家族的成员)在第672位天冬氨酰残基之前切割APP跨膜结构域N端(Yan等人，Nature，402533-537，1999)，形成截短形式的sAPPα，称为sAPPβ。剩余C端片段还可以由γ-分泌酶在第711位残基附近切割，产生可溶性Aβ肽。γ-分泌酶根据其切割位点而生成第1-39位、第1-40位、第1-42位、或第1-43位(其中第1位紧邻随β-分泌酶切割位点)氨基酸的Aβ肽。Aβ1-40是更加丰富的切割产物，大多数细胞类型都生成这种肽。除了由Aβ片段形成老年斑以外，在非纤维状、粒状联合中还可以检测到Aβ沉积，称为扩散斑(Tagliavini等人，Neurosci.Lett.，93191)。在正常的、健康的个体的大脑中能够检测到扩散Aβ斑，但在未患AD的个体的大脑中检测到很少的淀粉状蛋白生成性老年斑。针对Aβ肽的抗体染色揭示了扩散斑主要由高度淀粉状蛋白生成性Aβ1-42构成(Iwatsubo等人，Neuron，1345，1994)，而老年斑包含Aβ1-42和Aβ1-40肽二者的混合物。已经鉴定了导致APP切割成Aβ肽增加的几种淀粉状蛋白前体蛋白突变。“瑞典”突变即APP770第670/671位氨基酸残基KM变成NL的突变增加了Aβ1-40和Aβ1-42二者的产量(Citron等人，Nature，360672-674，1992；Lannfelt等人，Neurosci.Lett.，15385-87，1993)。“伦敦”突变即第717位残基V变成I、G、或F的突变同样导致Aβ肽片段的产量增加(Schenk等人，Nature，400173-177，1999)。还鉴定了其它几种突变，都围绕在APP中三个分泌酶切割位点之一周围，都导致Aβ切割增加。试图治疗AD的许多疗法都针对由分泌酶活性形成Aβ肽的过程，特别是参与将APP切割成Aβ肽的β和γ分泌酶。将APP切割成Aβ是天然酶促反应，在与神经元损伤无关的区域诸如基底膜、小动脉、和小静脉以及与AD病理学无关的大脑区域内生成Aβ肽。这些Aβ沉积通常自然扩散而非在纤维中沉积，而且细胞在整个生命过程中组成性分泌Aβ，在所有正常个体的脑脊液和血浆中都存在(Haas等人，Nature，359322-325，1992；Seubert等人，Nature，359325-327，1992)。这些和其它数据说明Aβ聚集(而非Aβ形成)代表了治疗性干预的另一个标靶。关于阿耳茨海默氏病和与多肽聚集有关的其它疾病的治疗性干预的一种最新方法是用抑制多肽成核/聚集的试剂进行处理。目前有几种筛选测定法可用于检测与各种人类衰弱性疾病有关的聚集蛋白质或聚集多肽。用于检测蛋白质聚集的一种独特方法称为时间分辨各向异性测量法(TRAMS Time Resolved Anisotropy Measurements)(Allsop等人，Biochem.Biophy.Res.Comm.，28558-63)，它测量溶液中荧光颗粒的运动。TRAMS要求将经过荧光标记的肽与未标记的肽以期望浓度混合，并在一段时间内进行各向异性测量。对于这种特殊测定法，使用经过修改的单一光子计数器来测量光发射光谱，其中光发射二极管的重复率为1MHz。荧光颗粒的运动随时间而减慢与聚集体数目增加有关。尽管TRAMS测定法可以测量蛋白质聚集的初始步骤，然而这种检测肽复合物的方法非常复杂，它需要不易获得的装备，且难以解释数据。闪烁近似测定法(scintillation proximity assay，SPA)也可用于评估β-淀粉状蛋白多肽的聚集。在SPA法中，采用了三种β-淀粉状蛋白1-40，即未标记的β-淀粉状蛋白、生物素化的β-淀粉状蛋白、和标记的β-淀粉状蛋白。让这三种肽的混合物于37℃聚集4小时。此时，向混合物中加入1mg经链霉亲和素包被的SPA珠(Amersham)，并于37℃保温几个小时，在不同时间点测量(珠中的)掺入。为了执行此方案，每次测定需要大量的β1-40，而且每次测定需要大量的时间来完成。因此，这种测定法不具有制药工业所需要的高通量能力，并且会使用潜在有害的试剂来完成该方案。在用于检测β-淀粉状蛋白聚集的标准酶联免疫吸收测定法(ELISA)方案中(Howlett等人，FEBS Letters，417249-251，1997)，用针对β-淀粉状蛋白肽的单克隆抗体(如抗体6E10，Senetek，纳巴，加利福尼亚州)包被聚苯乙烯微量滴定板。在另一个微量滴定板中，用适当缓冲液将β-淀粉状蛋白稀释至期望浓度，并在存在或缺乏测试化合物时让其聚集过夜。保温本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于鉴定多肽聚集调控物的方法，包括：ｉ）提供附着了第一结合配偶体的基质，其中第一结合配偶体结合第二结合配偶体；ｉｉ）提供包含多肽单体的多肽组合物，其中至少一些单体经修饰而包含第二结合配偶体；ｉｉｉ）在存在和不存在测试 试剂时，在多肽单体可聚集形成多聚体的条件下将多肽组合物保温；ｉｖ）使多肽组合物接触附着了第一结合配偶体的基质；并ｖ）通过检测与基质结合的多肽聚集体来测量多肽聚集，其中检测包括测量第二结合配偶体，根据存在和不存在测试试剂时多肽 聚集的不同将测试试剂鉴定为调控物化合物。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：ML比奇，AL拉波德，
申请(专利权)人：法玛西雅厄普约翰美国公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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