包含支架,佐剂和抗原的异源多聚体化合物及其用途制造技术

本发明专利技术提供了一种产物，其包括：第一组分，其为支架；第二组分，其为佐剂，优选为多肽，所述多肽是ＣＤ２１的配体或者是Ｂ细胞、Ｔ细胞、滤泡树突细胞或其它抗原呈递细胞的细胞表面分子的配体；和第三组分，其为抗原。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
,佐剂和抗原的异源多聚体化合物及其用途的制作方法
本专利技术涉及大分子聚集体(macromolecular assembly)诸如融合蛋白等，其包括佐剂和抗原，所述聚集体与单独的抗原相比可激发针对该抗原的增强的免疫反应。
技术介绍
佐剂增强对抗原的免疫反应，并由此可用于疫苗中。然而，仅许可有限数量的佐剂用于人体，由于从动物研究中得知了更强的佐剂，明显地需要可安全用于人的更强的免疫佐剂。最近的综述见“Advances in vaccineadjuvants”(nature Biotechnology，1999，第17卷，1075-1081页)。任何可广泛应用于人的佐剂的重要特征是所述佐剂应非常安全，这一点在将它用于大量健康人的常规疾病预防时尤其重要。补体系统由一系列血清蛋白组成，所述血清蛋白在免疫系统对外来抗原的应答中很重要。补体系统的初始组分(primary component)被切割时该系统被活化，且所得产物单独或与其它蛋白一起可活化其它补体蛋白，从而导致蛋白水解级联反应。所述补体系统的活化导致各种应答，包括血管通透性增加，对吞噬细胞的趋化作用，炎性细胞的活化，对外来颗粒的调理作用，直接杀死细胞以及组织损伤。补体系统的活化可通过抗原-抗体复合物(经典途径)激发，或者正常的慢速活化可在诸如细菌或病毒等的入侵微生物的细胞壁存在的条件下扩大(旁路途径)。补体系统与细胞免疫系统通过涉及C3的具体途径而发生相互作用，所述C3为经典和旁路途径中的重要蛋白。C3的蛋白水解活化产生了大的片段(C3b)，并暴露了具有化学反应性的内部硫羟酸酯键，其可以与诸如入侵微生物或外源细胞的细胞表面蛋白等外部亲核物质共价结合。结果，所述潜在的抗原由C3b“标记”，并在C3b经过进一步蛋白水解变为iC3b和C3d，g的过程中保持与其相结合。后两种片段分别是补体受体CR3和CR2的配体；(CR2也称为CD21)。因此，C3b对抗原进行标记可导致对携带这些受体的免疫系统细胞的靶向机制。这种靶向对于放大免疫应答的重要性首先通过实验显示，所述实验中，消耗小鼠的循环C3并随后用抗原(绵羊红细胞)进行攻击。去除C3可减轻抗体对该抗原的应答(M.B.Pepys，J.Exp.Med.，140,126-145，1974)。C3的作用通过动物研究证实，所述动物的C3或可产生C3b的补体级联反应上游组分(即C2和C4)是遗传缺陷的(J.M.Ahearn and D.T.Fearon，Adv.Immunol.，46，183-219，1989)。最近发现，与未修饰的抗原对照相比，模型抗原与两个以上拷贝的小鼠C3d片段序列的线性结合导致的小鼠体内抗体应答大大增强(1000-10000-倍)(P.W.Dempsey等，Science，271,348-350，1996；W096/17625，PCT/GB95/02851)。所述增强可不使用传统佐剂诸如Freud’s完全佐剂等而产生，所述佐剂对用于人体而言毒性太大。这一显著效应的机制被证实是多价C3d构建体与B细胞上的CR2的高亲和力结合，然后CR2与另一B细胞膜蛋白CD19以及膜结合的免疫球蛋白共-连接(co-ligation)，以对B细胞的细胞核发出信号。然而，证明难以产生大量含有三个拷贝的C3d的同源重组蛋白。主要的问题是i)含有(三个)重复序列的构建体的遗传不稳定性和ii) 重组蛋白的折叠(或溶解和重折叠)，所述重组蛋白来自大肠杆菌中形成的包涵体。最小化含有C3d基因重复拷贝的构建体的遗传不稳定性的一种方法描述于W099/35260和W001/77324中。这些应用中所述的技术是利用编码C3d重复的DNA的非-同一性序列。WO00/69907和WO00/69886(所述文献的内容包含在本文中作为参考)描述了能够组装成多聚体形式的多肽单体。所述单体来自伴侣分子蛋白，具体是GroES或Cpn10家族的成员。利用补体4结合蛋白(C4bp)的多聚化系统描述于WO 91/11461中。人C4b-结合蛋白(C4BP)是高分子量(570kDa)的血浆糖蛋白，其具有蜘蛛样结构(spider like structure)，所述结构由7条相同的α链和单个β链组成。所述C4bpα链具有负责将该分子组装成多聚体的C-末端核心区。根据标准模型，一个C4bp单体+498位的半胱氨酸与另一单体+510位的半胱氨酸形成二硫键。在人血浆中还发现了只包含7个α链的较小形式(minor form)。这种血浆糖蛋白的天然功能是抑制补体活化的经典途径。WO91/11461提出C4bp蛋白的多聚化能力可以用来制备包含全部或部分C4bp和目的(interested)生物蛋白的融合蛋白。这个融合蛋白将形成多聚体，该多聚体为目的蛋白提供平台，其中所述蛋白有更长的血浆半衰期并且对其靶的亲和力(affinity)或亲合力(avidity)更强。在WO91/11461中，C4bp融合蛋白成为治疗性产品的新的递送和载体系统的焦点。C4bp的大多数α链由8个长度约为60个氨基酸的结构域串联排列组成，该结构称为补体控制蛋白(complement control protein)(CCP)重复。WO91/11461中描述的融合蛋白中，优选包含一个或多个这样的结构域。但是现已证实，所有的CCP都能缺失(只留下C-末端的57个氨基酸)，而不会抑制多聚化(Libyh M.T.等，(1997)Blood 90，3978)。C4bp的这个C-末端区域称为C4bp核心。Libyh等(1997)描述了基于C4bpα链C-末端部分的蛋白多聚化系统。C4bp的C-末端部分缺乏生物功能，但是它负责使产生C4bp的CHO细胞胞浆中的C4bp发生多聚化。Libyh等能够用C4bp片段诱导相关抗体片段的自发多聚化，从而产生ScFv片段的同源多聚体。所用C4bp的C-末端部分被置于ScFv序列的C-末端，可选由MYC标记隔开(space)。C4bp的用途还描述于Oudin等(2000，Journal of Immunology，164，1505)和Christiansen等(2000，Journal of Virology，74，4672)中。自我装配型多聚体可溶性CD4-C4bp融合蛋白在Shinya等(1999，Biomed & Pharmacother，53，471)中也已经得到了证实，所述融合蛋白可在人293细胞系中表达。专利技术概述本专利技术提供了包含以下组分的产物第一组分，其为支架；第二组分，其为佐剂，优选是多肽，所述多肽是CD21的配体或者是B细胞、T细胞、滤泡树突细胞或其它抗原呈递细胞的细胞表面分子的配体；知第三组分，其为抗原。第一组分提供了多拷贝的第二组分在多组分产物中的聚集，使得所述多拷贝的第二组分与一或多个拷贝的抗原结合。在优选的方面，本专利技术提供了第一组分，其为多肽支架； 第二组分，其为多肽，所述多肽是CD21的配体或者是B细胞、T细胞、滤泡树突细胞或其它抗原呈递细胞的细胞表面分子的配体；和第三组分，其为抗原。所述第一和第二组分可以是融合蛋白。当第三组分为多肽时，所述三组分作为融合蛋白存在。可选，所述第三组分与前两种组分的融合物共价连接。一些情况本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产物，其包括第一组分，其为支架第二组分，其为佐剂；和第三组分，其为抗原。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：皮埃尔安德里奥雷蒂，劳伦斯杜蒙，费高尔希尔，米歇尔朱利恩，让B马钱德，伊曼纽尔里西，
申请(专利权)人：阿维迪斯公司，
类型：发明
国别省市：FR[法国]