白蛋白变体制造技术

本发明专利技术涉及一种亲本白蛋白的变体，这些变体与该亲本白蛋白相比具有改变的血浆半衰期。本发明专利技术还涉及编码这些变体的多核苷酸；包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞；以及使用这些变体的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】白蛋白变体 序列表的引用 本申请含有一个计算机可读形式的序列表，该序列表通过引用结合在此。 专利技术背景 专利
本专利技术涉及白蛋白变体或其片段或者包含变体白蛋白或其片段的融合多肽，它们 与白蛋白、其片段或包含白蛋白或其片段的融合多肽相比，具有在对FcRn的结合亲和力方 面的改变和/或在半衰期方面的改变。本专利技术允许根据用户或应用的要求和愿望定制白蛋 白的结合亲和力和/或半衰期。 相关技术说明 白蛋白是一种在哺乳动物血浆中天然发现的蛋白质，它是血浆中最丰富的蛋白 质。它在维持所希望的血液渗透压方面具有重要作用，并且在血流中的各种物质的运输中 也具有重要作用。白蛋白已经从包括人类、猪、小鼠、大鼠、兔、以及山羊的许多物种中得以 表征，并且它们享有高度的序列和结构同源性。 白蛋白体内结合至它的受体，即新生儿Fc受体（FcRn) "布兰贝尔（Brambell) "， 并且已知这种相互作用对于白蛋白的血浆半衰期是重要的。FcRn是一种膜结合蛋白， 被表达在许多细胞和组织类型中。已经发现FcRn可回收来自细胞内降解的白蛋白（罗 帕宁（Roopenian)D.C.和阿基里奇（Akilesh)，S. (2007)，《自然综述免疫学》（似丨·!^^ Immunol) 7, 715-725.) JcRn是一种双功能分子，有助于维持哺乳动物如人类的血浆中高水 平的IgG和白蛋白。 而FcRn-免疫球蛋白（IgG)相互作用已经得以在现有技术中表征，FcRn-白蛋 白相互作用没有被较好地表征。主要的FcRn结合位点位于DIII内（381-585)，（安徒生 (Andersen)等人（2010)，《临床生物化学》（Clinical Biochemistry)43, 367-372)。多个 关键氨基酸已经显示在结合中是重要的，尤其是组氨酸H464、H510和H536以及Lys500 (安 徒生等人（2010)，《自然通讯》（Nat. Commun. )3:610. DOI: 10. 1038/ncommsl607)。数据指 示IgG和白蛋白非协作式地结合至FcRn上的相异位点（安徒生等人（2006)，《欧洲免疫 学杂志》（Eur.J. Immunol)36, 3044-3051 ;乔杜里（Chaudhury)等人（2006)，《生物化学》 (Biochemistry)45, 4983-4990.)。 已知的是FcRn结合来自小鼠和人类的IgG，然而人类FcRn显现是更有差别的（奥 伯（Ober)等人（2001)《国际免疫学》（Int. Immunol) 13, 1551-1559)。安徒生等人（2010) 《生物化学杂志》（Journal of Biological Chemistry) 285 (7) :4826-36描述了人类和小鼠 FcRn对于小鼠和人类各自的白蛋白的亲和力（所有可能的组合）。在生理pH下观察到来 自任一物种的白蛋白对任一受体的非结合。在酸性pH下，观察到结合亲和力的100倍的区 另IJ。在所有情况下，来自任一物种的白蛋白和IgG与两种受体的结合是附加的。 人血清白蛋白（HSA)已经被良好地表征为具有585个氨基酸的多肽，它的序列可 以发现于彼得斯（Peters)，T.，Jr. (1996)《关于白蛋白的全部：生物化学，遗传学与医学应 用》(All about Albumin:Biochemistry, Genetics and Medical, Applications)pplO,学术 出版社公司（Academic Press, Inc.)，奥兰多（Orlando) (ISBN 0-12-552110-3)中。它对其 受体FcRn具有特征性结合，其中它在pH6. 0而不是在pH7. 4时结合。 已经发现HSA的血浆半衰期是大约19天。已经鉴定出具有更低血浆半衰期的天 然变体（皮奇（Peach)，R. J.和布伦南（Brennan)，S. 0·，（1991)《生物化学与生物物理学 报》(Biochim Biophys Acta. ) 1097:49-54)，具有取代D494N。在该变体中该取代产生了一 个N-糖基化位点，该位点在野生型白蛋白中是不存在的。不知道的是糖基化或氨基酸改变 是否对血浆半衰期的改变有贡献。 白蛋白具有长的血浆半衰期，并且由于此特性它已经被建议用于药物递送中。已 经将白蛋白轭合至药学上有益的化合物（W0 2000/69902)，并且发现该轭合物维持白蛋白 的长的血浆半衰期。通常认为所得的轭合物的血浆半衰期显著长于单独的有益治疗化合物 的血衆半衰期。 另外，已经将白蛋白从遗传学角度融合至治疗有益肽中（W0 2001/79271 A和WO 2003/59934)，伴随的典型结果是该融合物具有治疗有益肽的活性以及比该单独的治疗有 益肽的血浆半衰期显著更长的血浆半衰期。 小田切（Otagiri)等人（2009)，《生物与制药公报》（Biol. Pharm. Bull. )32(4),527-534披露了多于70种白蛋白变体中发现有25种在结构域III中具突 变。在羧基端缺乏最后175个氨基酸的天然变体已经显示具有减少的半衰期（安徒生等人 (2010)，《临床生物化学》(Clinical Biochemistry)43, 367-372)。岩夫（Iwao)等人（2007) 使用小鼠模型研宄了天然存在的人白蛋白变体的半衰期，并且发现K541E和K560E具有减 少的半衰期，E501K和E570K具有最佳的半衰期，并且K573E对半衰期几乎没有影响（岩夫 等人（2007)Β·Β·Α·《蛋白质与蛋白质组学》(Proteins and Proteomics) 1774, 1582-1590)。 加利亚诺（Galliano)等人（1993)《生物化学与生物物理学报》（Biochim. Biophys.Acta) 1225, 27-32 披露了一种天然变体 E505K。明基奥蒂（Minchiotti)等人 (1990)披露了一种天然变体K536E。明基奥蒂等人（1987)《生物化学与生物物理学报》 (Biochim. Biophys. Acta) 916, 411-418 披露了 一种天然变体 K574N。高桥（Takahashi)等 人（1987)《美国国家科学院院刊》(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 84, 4413-4417披露了一种天 然变体D550G。卡尔森（Carlson)等人（1992).《美国国家科学院院刊》（Proc. Nat. Acad. Sci. USA) 89, 8225-8229 披露了一种天然变体 D550A。 WO 2011/051489 和 TO 2012/150319(PCT/EP2012/058206)披露了在白蛋白中的 多个点突变，这些点突变调节白蛋白与FcRn的结合，WO 2010/092135披露了白蛋白中的多 个点突变，这些点突变增加了可用于白蛋白轭合的硫醇的数目，该披露没有记载关于突变 对白蛋白与FcRn的结合的影响。WO 2011/103076披露了白蛋白变体，各自包含HSA的结构 域III中的取代。WO 2012/本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多肽，该多肽是白蛋白的一种变体、其片段、或者包含所述变体白蛋白或其片段的融合多肽，该多肽在该白蛋白、片段或融合多肽的结构域I中具有一个或多个(若干个)改变，并且在该白蛋白、片段或融合多肽的结构域III中具有一个或多个(若干个)改变，并且与一种亲本白蛋白、参照白蛋白、其片段、或者包含所述亲本白蛋白、参照白蛋白或其片段或融合物的融合多肽对FcRn的结合亲和力相比具有对FcRn的改变的结合亲和力。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：K·A·德拉海，
申请(专利权)人：诺维信生物制药丹麦公司，
类型：发明
国别省市：丹麦;DK