白蛋白变体制造技术

本发明专利技术涉及与亲本白蛋白相比具有改变的血浆半衰期的亲本白蛋白的变体。本发明专利技术还涉及包括所述变体白蛋白的融合多肽和缀合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】白蛋白变体对序列表的引用本申请含有计算机可读形式的序列表，其并入本文以作参考。
本专利技术涉及白蛋白变体或其片段、或者包括变体白蛋白或其片段的融合多肽，其与白蛋白、其片段或者包括白蛋白或其片段的融合多肽相比较，与FcRn的结合亲和力有变化，并且/或者半衰期有变化。本专利技术使得人们可以根据用户或应用的要求和需求对白蛋白的结合亲和性和/或半衰期进行订制(tailoring)。
技术介绍
白蛋白是哺乳动物血浆中天然存在的蛋白质，其中它是丰度最高的蛋白质。它在维持血液的所需渗透压，以及另外在血流中各种物质的运输中具有重要的作用。来自许多物种包括人、猪、小鼠、大鼠、兔和山羊的白蛋白已经得以表征，它们享有高度的序列和结构同源性。白蛋白在体内与它的受体新生Fe受体(FcRn) “Brambell”结合，已知这种相互作用对于白蛋白的血浆半衰期非常重要。FcRn是一种膜结合蛋白质，在许多细胞和组织类型中得以表达。已经发现，FcRn对白蛋白进行补救以免遭细胞内降解(Roopenian D.C.和Akilesh, S.(2007)，Nat.Rev.1mmuno17, 715-725.)。FcRn 是有助于维持哺乳动物例如人类中高水平IgG和血清中白蛋白的双功能分子。尽管FcRn-免疫球蛋白(IgG)相互作用在现有技术中已得以表征,但FcRn-白蛋白相互作用较少得到表征。大多数FcRn结合位点位于DIII (381-585)内。Andersen等人(2010)在Clinical Biochemistry43, 367 - 372.上的数据表明，IgG和白蛋白非协同地与 FcRn 上的分离的位点结合(Andersen 等人,(2006), Eur.J.1mmuno 136, 3044-3051 ；Chaudhury 等人,(2006), Biochemistry45, 4983-4990.)。已知小鼠FcRn与来自小鼠和人的IgG结合,而人FcRn似乎更加有识别性(Ober等人,(2001) Int.1mmunol 13, 1551-1559)。Andersen 等人(2010)在 Journal of BiologicalChemistry285(7):4826-36中描述了人和小鼠FcRn各自对于小鼠和人白蛋白(所有可能的组合)的亲和力。在生理PH下未观察到来自任一物种的白蛋白与任一受体的结合。在酸性PH下，观察到100倍的结合亲和力的差异。在所有情况下，来自任一物种的白蛋白和IgG与两种受体的结合都是累加的。人血清白蛋白(HSA)作为一种585个氨基酸的多肽已经得到良好表征，其序列可见于 Peters, T.，Jr.(1996)All about albumin:Biochemistry, Genetics andMedical, Applications pplO, Academic Press, Inc.，Orlando (ISBNO-12-552110-3)。它与其受体FcRn有着特征性结合，其中其在pH6.0下发生结合，但在pH7.4下不发生结合。已经发现HSA的血浆半衰期为大约19天。已经识别出具有D494N取代的血半衰期较低的天然变体(Peach, R.J.和 Brennan, S.0., (1991) Biochim BiophysActa.1097:49-54)。这种取代在该变体中产生野生型白蛋白中所没有的N-糖基化位点。尚未知晓是糖基化还是氨基酸的变化是血浆半衰期变化的原因。白蛋白的血浆半衰期长，由于这一特性，已经提出将其用于药物输送。已经将白蛋白与药学有益的化合物缀合(conjugate) (W02000/69902A)，且发现缀合物保持白蛋白的长血浆半衰期。所得缀合物的血浆半衰期通常大大长于单独的有益治疗化合物的血浆半衰期。而且，已将白蛋白与治疗有益的肽进行基因融合(W02001/79271A和W02003/59934A)，通常的结果是，融合物具有治疗有益的肽的活性，并且血浆半衰期比单独的治疗有益的肽的血浆半衰期要长得多。Otagiri 等人(2009)在 Biol.Pharm.Bull.32 (4)，527-534 中公开了超过 70 种白蛋白变体，发现它们当中有25种在结构域III中发生了突变。已经表明，缺少羧基端最后175个氨基酸的天然变体具有减少的半衰期(Andersen等人(2010)，ClinicalBiochemistry43, 367-372)。Iwao等人(2007)使用小鼠模型研究了天然的人白蛋白变体的半衰期，发现K541E和K560E具有减少的半衰期，E501K和E570K具有增加的半衰期，K573E对半衰期几乎没有影响(Iwao等人(2007)B.B.A.Proteins andProteomicsl774, 1582-1590)。Galliano 等人(1993)在 Biochim.Biophys.Actal225, 27-32 中公开了天然变体 E505K。Minchiotti 等人(1990)公开了天然变体 K536E。Minchiotti 等人(1987)在Biochim.Biophys.Acta916, 411-418 中公开了天然变体 K574N。Takahashi 等人(1987)在Proc.Natl.Acad.Sc1.USA84, 4413-4417 中公开了天然变体D550G。Carlson 等人(1992)在Proc.Nat.Acad.Sc1.USA89, 8225-8229 中公开了天然变体 D550A。W02011/051489 (PCT/EP2010/066572)中公开了几种白蛋白中的调节白蛋白与FcRn结合的点突变，W02010/092135中公开了几种白蛋白中的增加可用于白蛋白中缀合的硫醇数目的点突变，这些公开内容没有提及突变对于白蛋白与FcRn结合的影响。W02011/103076公开了各自在HSA的结构域III中含有取代的白蛋白变体。白蛋白具有与数种配体结合的能力，这些配体变得与白蛋白缔合(associate)。这一特性已经被用来延长能够与白蛋白非共价结合的药物的血浆半衰期。这也可以通过以下方法实现:将没有或几乎没有白蛋白结合特性的药学有益化合物与具有白蛋白结合特性的部分结合起来。参见以下的综述性文章和其中的参考文献=Kratz (2008) Journal ofControlled Releasel32，171-183。白蛋白被用于药学有益化合物的制剂中，其中这样的制剂可以是，例如，但不限于，白蛋白的纳米颗粒或微米颗粒。在这些例子中，药学有益化合物或化合物混合物的递送可以得益于白蛋白与其受体亲和力的改变，其中已经显示有益化合物与白蛋白缔合作为递送手段。尚不清楚是何因素决定所形成的缔合物(例如但不限于+Levemir?，Kurtzhals P等人，Biochem.J.1995 ；312:725-731)、缀合物或融合多肽的血浆半衰期，但这似乎是白蛋白和所选择的药学有益化合物/多肽的组合的结果。能够控制给定的白蛋白缀合物、缔合物或白蛋白融合多肽的血浆半衰期将会是合意的，从而可以获得比由缔合、缀合或融合的组份所给出的血浆半衰本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备多肽的方法，所述多肽是白蛋白变体、其片段或者包括所述变体白蛋白或其片段的融合多肽，其与参照白蛋白、其片段或融合物对FcRn的结合亲和力相比较，具有改变的FcRn结合亲和力，所述方法包括：（a）提供编码与SEQ ID NO:2具有至少80%序列同一性的亲本白蛋白的核酸；（b）修饰步骤（a）的序列以编码多肽，所述多肽是变体白蛋白、其片段或者包括所述变体白蛋白或其片段的融合多肽，其在具有A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y中的一个或多个且与SEQ ID NO:2中选自以下的位置相对应的一个或多个位置处，具有一个或多个改变：（a）75‑91中的任意（优选83）；（b）492‑538中的任意；（c）505、531、524、472、108、190、197和425；（d）186‑201中的任意；（e）457‑472中的任意；（f）414‑426中的任意；（g）104‑120中的任意；（h）144‑150中的任意；（i）30‑41中的任意；（j）550‑585中的任意；（k）276、410和414中的任意；其中当多肽包括一个或多个选自以下的改变时：（i）位置417、464、492、493、494、495、496、499、500、501、503、504、505、506、510、535、536、537、538、540、550、573、574、575、577、578、579、580、581、582和584；（ii）在一个或多个（若干个）位置34、38、40、75、76、80、82、83、86、90、104、113、115、116、471、496、498、501、503、504、505、506、512、538、550、560、562、564、565、573、574、577、578、579、580、581、582、584、585处用Cys插入或取代；（iii）一个或多个（若干个）位置91、200、461、514、558、559、567处的改变，以破坏二硫键，和/或（iv）D63N、E82K、E84K、D87N、L90P、K106E、R114G、E119K、V146E、H464A、H464N、C201F、D494N、E501K、E503K、E505K、H510A、I513N、D518N、K525E、E529K、V533M、H535A、K536E、I537N、D550G、D550A、V557M、K560E、D563N、E565K、E570K、K573E、K574N、K574E、K584E；所述多肽还包括一个或多个在以下位置处的改变：位置30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、144、145、146、147、148、149、150、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、276、410、411、414、415、416、418、419、420、421、422、423、424、425、426、457、458、459、460、461、462、463、465、466、467、468、469、470、471、472、497、498、502、507、508、509、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、567、568、569、570、571、572、576、583、585，和/或在选自497‑585的位置处插入或取代的终止密码子；（c）将步骤（b）中的修饰序列引入到合适的宿主细胞中；（d）使所述细胞在导致所述多肽表达的条件下在合适的生长培养基中生长；（e）从生长培养基中回收所述多肽；其中所述多肽与亲本白蛋白、参照白蛋白、其片段或者包括所述亲本白蛋白、参照白蛋白或其片段或融合物的融合多肽的半衰期相比较，具有改变的FcRn结合亲和力和/或改变的血浆半衰期。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.05.05 EP 11164991.9;2011.10.13 EP 11185064.0;1.一种制备多肽的方法，所述多肽是白蛋白变体、其片段或者包括所述变体白蛋白或其片段的融合多肽，其与参照白蛋白、其片段或融合物对FcRn的结合亲和力相比较，具有改变的FcRn结合亲和力，所述方法包括: Ca)提供编码与SEQ ID N0:2具有至少80%序列同一性的亲本白蛋白的核酸； (b)修饰步骤(a)的序列以编码多肽，所述多肽是变体白蛋白、其片段或者包括所述变体白蛋白或其片段的融合多肽，其在具有六、(:、03、卩、6、!1、1、1(、1^、厘、队？、0、1?、5、1\￥、评、Y中的一个或多个且与SEQ ID NO: 2中选自以下的位置相对应的一个或多个位置处，具有一个或多个改变:(a) 75-91中的任意(优选83) ；(b) 492-538中的任意；(c) 505、531、524、472、108、190、197 和 425 ；(d)186-201 中的任意；(e)457_472 中的任意；(f)414_426 中的任意；(g) 104-120中的任意；(h) 144-150中的任意；(i) 30-41中的任意；(j) 550-585中的任意；(k) 276、410和414中的任意；其中 当多肽包括一个或多个选自以下的改变时:(i)位置417、464、492、493、494、495、496、499、500、501、503、504、505、506、510、535、536、537、538、540、550、573、574、575、577、578、579、580、581、582 和 584 ； (ii)在一个或多个(若干个)位置34、38、40、75、76、80、82、83、86、90、104、113、115、116、471、496、498、501、503、504、505、506、512、538、550、560、562、564、565、573、574、577、578、579、580、581、582、584、585 处用 Cys 插入或取代； (iii)一个或多个(若干个)位置91、200、461、514、558、559、567处的改变，以破坏二硫键，和/或(iv)D63N、E82K、E84K、D87N、L90P、K106E、Rl 14G、El 19K、V146E、H464A、H464N、C201F、D494N、E501K、E503K、E505K、H510A、I513N、D518N、K525E、E529K、V533M、H535A、K536E、I537N、D550G、D550A、V557M、K560E、D563N、E565K、E570K、K573E、K574N、K574E、K584E ;所述多肽还包括一个或多个在以下位置处的改变:位置30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、144、145、146、147、148、149、150、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、276、410、411、414、415、416、418、419、420、421、422、423、424、425、426、457、458、459、460、461、462、463、465、466、467、468、469、470、471、472、497、498、502、507、508、509、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、567、568、569、570、571、572、576、583、585，和/或在选自497-585的位置处插入或取代的终止密码子； (C)将步骤(b)中的修饰序列引入到合适的宿主细胞中； Cd)使所述细胞在导致所述多肽表达的条件下在合适的生长培养基中生长； Ce)从生长培养基中回收所述多肽； 其中所述多肽与亲本白蛋白、参照白蛋白、其片段或者包括所述亲本白蛋白、参照白蛋白或其片段或融合物的融 合多肽的半衰期相比较，具有改变的FcRn结合亲和力和/或改变的血浆半衰期。2.根据权利要求1所述的方法，其中当所述多肽包括一个或多个选自(ii)位置34、38、.40、75、76、80、82、83、86、90、91、104、113、115、116、200、461、471、496、498、501、503、504、.505、506、512、514、538、550、558、559、560、562、564、565、567、573、574、577、.578、579、580、.581、582、584、585 或者位置 82、114、119、464、201、505、510、513、533、535、536、.550、560、.563、565、573、574的改变时；所述多肽还包括一个或多个在选自以下位置处的改变:位置 30、31、32、33、35、36、37、39、41、77、78、79、81、84、85、87、88、89、105、106、.107、108、109、.110、111、112、117、118、120、144、145、146、147、148、149、150、186、187、188、.189、190、191、.192、193、194、195、196、197、198、199、201、276、410、411、414、415、416、418、.419、420、421、.422、423、424、425、426、457、458、459、460、462、463、465、466、467、468、469、.470、472、497、.502、507、508、509、511、513、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、.525、526、527、.528、529、530、531、532、534、551、552、553、554、555、556、557、561、568、569、.570、571、572、.576、583，和/或在选自497-585的位置处插入或取代的终止密码子。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述参照是HSA(SEQIDNo:2)或其片段，或者包括HSA或其片段的融合多肽，最优选为SEQ ID NO: 2。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述改变是取代。5.一种多肽，所述多肽是白蛋白变体、其片段或者包括所述变体白蛋白或其片段的融合多肽，其与亲本白蛋白、参照白蛋白、其片段或者包括所述亲本白蛋白、参照白蛋白或其片段或融合物的融合多肽对FcRn的结合亲和力相比较，具有改变的FcRn结合亲和力，所述多肽在具有 A、C、D、E、F、G、H、1、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y 中的一个或多个且与 SEQ IDNO: 2中选自以下的位置相对应的一个或多个位置处包括一个或多个改变:(a)75-91 (优选.83)； (b) 492-538 ; (c) 505、531、524、472、108、190、197 和 425 ；(d) 186-201 ；(e) 457-472 ；(f) 414-426 ；(g) 104-120 ；(h) 144-150 ；(i) 30-41 ；(j) 550-585 ；(k) 276,410 和 .414 中的任意；其中 当所述多肽包括一个或多个选自以下的改变时:(i)位置417、464、492、493、494、495、496、499、500、501、503、504、505、.506、510、535、.536、537、538、540、550、573、574、575、577、578、579、580、581、582 和 584 ； (ii)在一个或多个(若干个)位置34、38、40、75、76、80、82、83、86、90、104、113、.115、.116、471、496、498、501、503、504、505、506、512、538、550、560、562、564、565、.573、574、577、.578、579、580、581、582、584、585 处用 Cys 插入或取代； (iii)一个或多个(若干个)位置91、200、461、514、558、559、567处的改变，以破坏二硫键，和/或 (iv)位置D63N、E82K、E84K、D87N、L90P、K106E、R114G、E119K、V146E、H464A、H464N、C201F、D494N、E501K、E503K、E505K、H510A、I513N、D518N、K525E、E529K、V533M、H535A、K536E、I537N、D550G、D550A、V557M、K560E、D563N、E565K、E570K、K573E、K574N、K574E、K584E ； 所述多肽还包括一个或多个在以下位置处的改变:位置30、31、32、33、34、35、36、37、.38、39、40、41、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、.104、105、106、.107、108、109、I10、I...

【专利技术属性】
技术研发人员：JT安德森，B·达休斯，I桑德里，J卡梅伦，A普鲁姆里德格，E·P·弗里斯，K·德拉海，
申请(专利权)人：诺维信生物制药丹麦公司，
类型：发明
国别省市：丹麦;DK