基于流式细胞仪单荧光颗粒计数的核酸标志物数字式绝对定量分析方法技术

本发明专利技术公开了一种基于流式细胞仪单荧光颗粒计数的核酸标志物数字式绝对定量分析方法，该方法以粒径均匀的微球为载体，在微球表面合理固定特定核酸探针，通过控制条件，一个微球表面的核酸探针能特异性地和单个靶标核酸标志物分子结合，然后通过合理设计核酸扩增方法，使得该单分子引发的微球表面的信号扩增和荧光信号富集足够点亮该单个微球。而没有结合目标核酸标志物分子的微球，无法引发核酸扩增和荧光信号富集，呈现出阴性荧光信号。利用临床和普通实验室广泛配置的流式细胞仪即可区分出有荧光信号(阳性)和无荧光信号(阴性)微球的个数。因此，通过计数阳性微球的个数，可实现核酸标志物的数字式绝对定量分析。

Digital absolute quantitative analysis method of nucleic acid marker based on single fluorescence particle count of flow cytometer

【技术实现步骤摘要】
基于流式细胞仪单荧光颗粒计数的核酸标志物数字式绝对定量分析方法
本专利技术属于核酸标志物检测
，具体涉及一种以粒径均匀的微球作为载体构建单分子核酸扩增体系，以应用广泛的常规流式细胞仪作为单颗粒计数手段，从而实现核酸标志物数字式绝对定量分析。
技术介绍
遗传信息从基因组DNA转录为信使RNA(mRNA)，再由mRNA翻译为蛋白质，是基本的生命进程。在这一系列过程中，基因突变、DNA表观遗传学修饰、mRNA以及microRNA表达含量的失常均可能导致癌症的发生。因此，实现相关核酸标志物的高灵敏度准确分析对生命进程以及癌症诊断具有重要的意义。目前针对核酸标志物的高灵敏度分析，主要通过结合核酸扩增机制和实时荧光分析技术，其中实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)是应用最广泛的核酸标志物定量分析技术。然而，RT-qPCR技术是一种相对定量的分析方法，定量一般需依赖通过Ct值和已知拷贝数的标准品绘制的标准曲线。但是对于很多基因组DNA、mRNA，很难找到与待测物长度、结构完全一致的标准品(或稳定的内参)，同时，Ct值的准确性也受反应条件等因素的影响，易导致定量结果出现偏差。针对相对定量分析方法存在的问题，近年来兴起了一批数字式绝对定量分析方法。其中已商品化的微滴数字PCR(ddPCR)已经广泛应用于低拷贝数核酸标志物的绝对定量分析。ddPCR方法以一个微乳为反应单元，通过极度稀释理论使得一个微乳中最多包含有一个待测核酸标志物分子，然后单个微乳中单个核酸标志物分子引起的PCR扩增使得该微乳呈现阳性的荧光信号，通过计数阳性微乳的个数实现待测核酸标志物的绝对定量分析。该方法具有更高的准确度和灵敏度。然而，商品化的ddPCR仪器都很昂贵，微乳液滴的生成试剂都是各仪器公司的专利产品，一旦改变反应介质很容易破乳，所以较难方便地扩展应用于一些更高效的核酸扩增技术中。其次，ddPCR技术需要较为繁琐的微乳形成和液滴转移过程，在此过程中样品很容易受到影响。因此，考虑到核酸标志物检测对于高灵敏度、简单操作及普适性等方面的需求，理想的核酸标志物检测方法应具备类似ddPCR的数字式绝对定量原理，同时摆脱对微乳液滴的依赖，且满足稳定、价格低廉、高效灵敏、适用范围广等特点。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种操作简单、通用性强、无需昂贵仪器即可对核酸标志物进行数字式绝对定量的分析方法。解决上述技术问题所采用的技术方案由下述步骤组成：1、将能特异性识别靶标核酸标志物分子的核酸探针通过基团之间的反应或链霉亲和素与生物素之间的结合负载在微球上。2、利用步骤1中负载在微球上的核酸探针特异性地与靶标核酸标志物分子结合，使每个微球上只负载1个或0个靶标核酸标志物分子。3、通过每个靶标核酸标志物分子引发核酸扩增和荧光信号富集，使荧光富集效率足够点亮其负载的微球，呈现阳性荧光信号；其中负载0个靶标核酸标志物分子的微球呈现阴性荧光信号。4、利用流式细胞仪区分出阳性荧光信号微球和阴性荧光信号微球，根据阳性荧光信号微球的个数实现靶标核酸标志物的数字式绝对定量分析。上述步骤1中，所述基团之间的反应为氨基和羧基的反应、氨基和环氧基的反应、氨基和醛基的反应、氨基和酯基的反应中的任意一种。上述步骤1中，优选所述微球的粒径为1～50μm。上述步骤2中，所述核酸探针特异性地与靶标核酸标志物分子结合的方法为核酸杂交反应、酶催化连接反应、点击化学核酸连接反应中的任意一种。上述步骤2中，优选通过极度稀释使每个微球上只负载1个或0个靶标核酸标志物分子。上述步骤3中，所述核酸扩增为末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)引发的无模板核酸延伸扩增、滚环扩增等延伸扩增机制，以及杂交链式反应(HCR)等无酶催化核酸自组装信号放大机制中的任意一种或其组合；所述荧光信号富集的方法为杂交标记荧光基团的核酸、富集量子点、结合DNA单链染料(如OligoGreen)、嵌入DNA双链染料(如SYBRGreen)等中的任意一种。本专利技术的有益效果如下：1、本专利技术不再依赖昂贵的仪器，而是利用医院以及普通的科研实验室广泛配备的常规流式细胞仪作为单颗粒计数手段，增强了方法普适性的同时大大降低了检测成本。另外，流式细胞仪通过散射信号可以区分差别为0.5μm的微球，因此利用粒径编码可以实现高通量的核酸标志物同时检测。2、本专利技术方法中，以微球代替微乳液滴作为单个反应单元，相对于需要依赖特殊试剂且易破乳的微乳液滴来说，各种表面功能化的微球易于合成或商品化购买，稳定性高，能够耐受各种较极端的反应条件，适用于不同反应介质和各种高效的核酸扩增方法。另外，不需要微乳的形成和转移所需要的试剂和设备。因此该专利技术不仅操作简单而且普适高效。3、本专利技术建立的以流式细胞仪为计数手段的核酸标志物绝对定量方法操作简单，无需分离即可对阳性微球和阴性微球进行区分计数。且本专利技术中的微球数目可以根据需要增加，这样在不影响检测限的条件下可以大大拓宽检测范围。附图说明图1是实施例1中阳性微球随ath-miR156a浓度变化的前向散射光(FSC)强度和FL1通道荧光强度关系散点图。图2是实施例1中阳性微球比例随ath-miR156a浓度变化的标准曲线图。图3是实例1中实验所得阳性微球个数与理论阳性微球个数之间关系图。图4是实施例2中阳性微球随let-7a浓度变化的前向散射光(FSC)强度和FL1通道荧光强度关系散点图。图5是实施例2中阳性微球比例随let-7a浓度变化的标准曲线图。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术进一步详细说明，但本专利技术的保护范围不仅限于这些实施例。实施例1以基于点击化学核酸连接反应检测ath-miR156a分子为例，其绝对定量分析方法如下：1、将约6×105个5’端标记NH2、3’端标记DBCO(二苯基环辛炔)并且部分序列与ath-miR156a的一半互补的核酸探针A(核酸序列为：NH2-CCCCCCCCCCGTGCTCACTC-DBCO，由宝生物工程有限公司提供)与约1.45×105个标记环氧基的微球(M-270Epoxy，粒径为2.8μm，由英潍捷基贸易有限公司提供)在10μL体系中混合反应，使核酸探针A负载在微球上，并用三羟甲基氨基甲烷(Tris)封闭微球表面未反应的环氧基团。2、将步骤1反应后的微球进行磁分离，向分离后的微球中加入5’端标记N3、3’端为OH并且序列和ath-miR156a分子另一半互补的核酸探针B(核酸序列为：N3-TCTTCTGTCA，由宝生物工程有限公司提供)，并加入ath-miR156a分子和磷酸(PBS)缓冲溶液，使体系的终体积为10μL，并控制体系中核酸探针B的浓度为100fM，ath-miR156a分子的浓度分别为0、500aM、1fM、5fM、10fM、15fM、20fM，室温下进行点击化学核酸连接反应，反应时间为2h，使每个微球上负载1个或0个ath-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于流式细胞仪单荧光颗粒计数的核酸标志物数字式绝对定量分析方法，其特征在于它由下述步骤组成：/n(1)将能特异性识别靶标核酸标志物分子的核酸探针通过基团之间的反应或链霉亲和素与生物素之间的结合负载在微球上；/n(2)利用步骤(1)中负载在微球上的核酸探针特异性地与靶标核酸标志物分子结合，使每个微球上只负载1个或0个靶标核酸标志物分子；/n(3)通过每个靶标核酸标志物分子引发核酸扩增和荧光信号富集，使荧光富集效率足够点亮其负载的微球，呈现阳性荧光信号；其中负载0个靶标核酸标志物分子的微球呈现阴性荧光信号；/n(4)利用流式细胞仪区分出阳性荧光信号微球和阴性荧光信号微球，根据阳性荧光信号微球的个数实现靶标核酸标志物的数字式绝对定量分析。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于流式细胞仪单荧光颗粒计数的核酸标志物数字式绝对定量分析方法，其特征在于它由下述步骤组成：
(1)将能特异性识别靶标核酸标志物分子的核酸探针通过基团之间的反应或链霉亲和素与生物素之间的结合负载在微球上；
(2)利用步骤(1)中负载在微球上的核酸探针特异性地与靶标核酸标志物分子结合，使每个微球上只负载1个或0个靶标核酸标志物分子；
(3)通过每个靶标核酸标志物分子引发核酸扩增和荧光信号富集，使荧光富集效率足够点亮其负载的微球，呈现阳性荧光信号；其中负载0个靶标核酸标志物分子的微球呈现阴性荧光信号；
(4)利用流式细胞仪区分出阳性荧光信号微球和阴性荧光信号微球，根据阳性荧光信号微球的个数实现靶标核酸标志物的数字式绝对定量分析。


2.根据权利要求1所述的基于流式细胞仪单荧光颗粒计数的核酸标志物数字式绝对定量分析方法，其特征在于：步骤(1)中，所述基团之间的反应为氨基和羧基的反应、氨基和环氧基的反应、氨基和醛基的反应、氨基和酯基的反应中的任意一种。


3.根据权利要求1所述的基于流式细胞仪单荧光颗粒计数的核酸标志物数字式绝对定量...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘成辉，范文娇，祁艳，卢晓慧，
申请(专利权)人：陕西师范大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61