用于马铃薯淀粉真伪鉴别及其掺杂分析的荧光定量PCR检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于马铃薯淀粉真伪鉴别及其掺杂分析的荧光定量PCR检测方法，包括如下步骤：A、从待测淀粉中提取其DNA；B、荧光定量PCR引物设计；C、荧光定量PCR反应体系和操作程序；D、鉴定分析：如果所得结果中显示有一条扩增曲线，且同时满足两个特定条件，则鉴定被测品被测品为真马铃薯淀粉；如果所得结果显示有多条扩增曲线，且其中一条曲线同时满足两个特定条件，则鉴定被测品为掺假马铃薯淀粉；如果所得结果显示有多条曲线，但是所有曲线均不能同时满足两个特定条件，则鉴定被测品为不含马铃薯淀粉。本发明专利技术提供的荧光定量PCR技术对于淀粉及制品中掺假检验具有快速、简单、准确、特异性好和灵敏度高特性，为食品检验分析提供有力的手段。

Fluorescence quantitative PCR method for identification of potato starch and its adulteration

【技术实现步骤摘要】
用于马铃薯淀粉真伪鉴别及其掺杂分析的荧光定量PCR检测方法
本专利技术涉及食品检测
一种，尤其涉及淀粉类产品的生物检测技术及应用。
技术介绍
淀粉类食品一直是我们日常生活中较为常见的食品，现阶段的淀粉已经不仅仅只为人们日常所食用，更是作为一种工业原料在人类生活中应用广泛。目前常见的淀粉种类有：红薯淀粉、马铃薯淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、苜蓿淀粉等，不同的淀粉之间理化性质都有所不同且原料的成本和加工工艺使得不同的淀粉在价格上有所差异，由于以上原因导致淀粉及制品中掺假现象越发严重。这些掺假的淀粉及制品，不仅会对人的身体健康造成巨大的影响，更是一种商业欺诈行为，严重打乱了市场秩序，所以一种能够快速准确的鉴别出淀粉及制品中掺假成分的方法是十分重要的。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种用于马铃薯淀粉真伪鉴别及其掺杂分析的荧光定量PCR检测方法。为解决上述技术问题，本专利技术所采取的技术方案如下。用于马铃薯淀粉真伪鉴别及其掺杂分析的荧光定量PCR检测方法，包括如下步骤：A、针对待测淀粉均呈现为干品的特点，淀粉中含有包括糖类在内的多种次生代谢产物对DNA提取造成干扰，采用具有针对性的特定提取方法从待测淀粉中提取其DNA；B、荧光定量PCR引物设计：以序列表中SEQIDNO：1、SEQIDNO：2所示的人工核苷酸序列为上下游引物；以序列表中SEQIDNO：3所示的人工核苷酸序列为探针；对待测样品进行检测；C、根据待测品及所设计引物的特点，设置特定的荧光定量PCR反应体系和操作程序，完成荧光定量PCR；D、鉴定分析：D-1、如果所得结果中显示有一条扩增曲线，且同时满足如下两个条件：①曲线的起跳在15-25个循环之前；②扩增浓度数值不低于2-5；则鉴定被测品被测品为真马铃薯淀粉；D-2、如果所得结果显示有多条扩增曲线，且其中一条曲线同时满足如下两个条件：①曲线的起跳在15-25个循环之前；②扩增浓度数值不低于2-5；则鉴定被测品为掺假马铃薯淀粉；D-3、如果所得结果显示有多条曲线，但是所有曲线均不能同时满足如下两个条件：①曲线的起跳在15-25个循环之前；②扩增浓度数值不低于2-5；则鉴定被测品为不含马铃薯淀粉；D-4、如果所得结果显示没有扩增曲线，则鉴定被测品为不含马铃薯淀粉。作为本专利技术的一种优选技术方案，步骤A中，所述从待测淀粉中提取其DNA的特定方法，包括如下步骤：A-1、称取样品100mg，放入研钵中，加入定量的液氮进行充分地研磨，制成样品粉末；A-2、将缓冲液GP1放入水浴锅65℃中，进行预热处理，同时加入0.1%浓度体积的巯基乙醇；A-3、将样品粉末放入经过处理的缓冲液GP1中了，快速地颠倒晃匀，混匀后将离心管迅速地放入水浴锅65℃中，并保持20min，并在这段时间内不断地颠倒晃匀样品；A-4、把700µL氯仿加入离心管中，颠倒晃匀，并在离心机上以12000转下进行离心，时间为5min；A-5、离心好后吸取上清液加入另一个的离心管中，同时把700µL缓冲液GP2加入，颠倒晃匀；A-6、将混匀好的缓冲液GP2转入吸附柱GB3，并在离心机上以12000转下离心30s，去除上清液；A-7、把500µL缓冲液GD加入吸附柱GB3，并在离心机上以12000转下离心30s，去除上清液，同时在收集管中放进吸附柱GB3；A-8、把600µL漂洗液PW加入吸附柱GB3，并在离心机上以12000转下离心30s，去除上清液，同时在收集管中放进吸附柱GB3，多次重复此步骤；A-9、将装有吸附柱GB3的收集管，放在离心机上以12000转下离心2min，去除上清液；并将吸附柱GB3在室温下放置几分钟，确保吸附柱中的残留漂洗液PW去除；A-10、将完全将漂洗液去除干净的吸附柱GB3放入新的离心管中，并将50-200µL的洗脱缓冲液TE悬空滴加在吸附膜中间部位，并在室温下放置几分钟，之后在离心机上以12000转下离心2min，收集上清液，即得。作为本专利技术的一种优选技术方案，步骤C中，荧光定量PCR的反应体系设置为：采用25μL的扩增体系，其中添加2xSuperRealPreMixProbe12.5μL、上游引物的浓度为10μmol/L，用量为0.75μL、下游引物的浓度为10μmol/L，用量为0.75μL、探针的浓度为10μmol/L，用量为0.5μL、DNA模板为2.0μL、ddH2O为8.5μL；以无菌双蒸水作为空白对照。作为本专利技术的一种优选技术方案，步骤C中，荧光定量PCR的操作程序设置为：95℃预变性时间为15min；95℃变性时间为3sec，60℃退火/延伸时间为20sec，对荧光信号进行采集，共计40个循环。作为本专利技术的一种优选技术方案，步骤D中，所述两个条件为：①曲线的起跳在16-20个循环之前；②扩增浓度数值不低于2.5-4。作为本专利技术的一种优选技术方案，步骤D中，所述两个条件为：①曲线的起跳在18个循环之前；②扩增浓度数值不低于3。采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本专利技术首先针对待测淀粉均呈现为干品的特点，淀粉中含有包括糖类在内的多种次生代谢产物对DNA提取造成干扰，研究了具有针对性的特定提取方法从待测淀粉中提取其DNA，得到最佳提取基因组的操作方法。尤为关键的，本专利技术根据通过基因序列分析探究设计了淀粉产品的引物和探针，并通过系列理论和试验研究及筛选，得到了具有高特异性、高灵敏度、易于定量分析的引物序列。通过系列试验研究证实了本专利技术的方法具有高度特异性，能够准确鉴别出淀粉的品种。通过系列试验研究证实了使用荧光定量PCR技术对待测品进行检验具有极高的灵敏度，且在掺假实验中能够准确的检验出样品掺假情况。最后，本专利技术基于试验数据进一步设定了行之有效的快速判定方法，而且这些判定方法容易实现自动化分析，这是本专利技术的关键所在。综上，本专利技术提供的荧光定量PCR技术对于淀粉及制品中掺假检验具有快速、简单、准确、特异性好和灵敏度高特性，为食品检验分析提供有力的手段。附图说明图1是实施例中的马铃薯特异性检验结果。图中A为马铃薯基因组，B为红薯基因组，C为玉米基因组、D组为木薯、苜蓿、芝麻、核桃、大豆、榛子、牛肉、羊肉、鸡肉、猪肉的基因组DNA。图2是实施例中的马铃薯灵敏度检验结果。具体实施方式以下实施例详细说明了本专利技术。本专利技术所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。实施例1、材料和仪器。淀粉等各种食品原材料均购于商业超市。实验所用的涡旋振荡器是IKA公司生产的MS3基本型涡旋混匀仪，离心机为Eppendoff公司生产的小型台式离心机，核酸蛋白分析仪为Thermo公司生产的nanodroplite型号，罗氏480荧光定量PCR仪，电子天平为梅特勒公司生产的ME002型号分析天平，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于马铃薯淀粉真伪鉴别及其掺杂分析的荧光定量PCR检测方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：/nA、针对待测淀粉均呈现为干品的特点，淀粉中含有包括糖类在内的多种次生代谢产物对DNA提取造成干扰，采用具有针对性的特定提取方法从待测淀粉中提取其DNA；/nB、荧光定量PCR引物设计：以序列表中SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示的人工核苷酸序列为上下游引物；以序列表中SEQ ID NO：3所示的人工核苷酸序列为探针；对待测样品进行检测；/nC、根据待测品及所设计引物的特点，设置特定的荧光定量PCR反应体系和操作程序，完成荧光定量PCR；/nD、鉴定分析：/nD-1、如果所得结果中显示有一条扩增曲线，且同时满足如下两个条件：①曲线的起跳在15-25个循环之前；②扩增浓度数值不低于2-5；则鉴定被测品被测品为真马铃薯淀粉；/nD-2、如果所得结果显示有多条扩增曲线，且其中一条曲线同时满足如下两个条件：①曲线的起跳在15-25个循环之前；②扩增浓度数值不低于2-5；则鉴定被测品为掺假马铃薯淀粉；/nD-3、如果所得结果显示有多条曲线，但是所有曲线均不能同时满足如下两个条件：①曲线的起跳在15-25个循环之前；②扩增浓度数值不低于2-5；则鉴定被测品为不含马铃薯淀粉；/nD-4、如果所得结果显示没有扩增曲线，则鉴定被测品为不含马铃薯淀粉。/n...

【技术特征摘要】
1.用于马铃薯淀粉真伪鉴别及其掺杂分析的荧光定量PCR检测方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
A、针对待测淀粉均呈现为干品的特点，淀粉中含有包括糖类在内的多种次生代谢产物对DNA提取造成干扰，采用具有针对性的特定提取方法从待测淀粉中提取其DNA；
B、荧光定量PCR引物设计：以序列表中SEQIDNO：1、SEQIDNO：2所示的人工核苷酸序列为上下游引物；以序列表中SEQIDNO：3所示的人工核苷酸序列为探针；对待测样品进行检测；
C、根据待测品及所设计引物的特点，设置特定的荧光定量PCR反应体系和操作程序，完成荧光定量PCR；
D、鉴定分析：
D-1、如果所得结果中显示有一条扩增曲线，且同时满足如下两个条件：①曲线的起跳在15-25个循环之前；②扩增浓度数值不低于2-5；则鉴定被测品被测品为真马铃薯淀粉；
D-2、如果所得结果显示有多条扩增曲线，且其中一条曲线同时满足如下两个条件：①曲线的起跳在15-25个循环之前；②扩增浓度数值不低于2-5；则鉴定被测品为掺假马铃薯淀粉；
D-3、如果所得结果显示有多条曲线，但是所有曲线均不能同时满足如下两个条件：①曲线的起跳在15-25个循环之前；②扩增浓度数值不低于2-5；则鉴定被测品为不含马铃薯淀粉；
D-4、如果所得结果显示没有扩增曲线，则鉴定被测品为不含马铃薯淀粉。


2.根据权利要求1所述的用于马铃薯淀粉真伪鉴别及其掺杂分析的荧光定量PCR检测方法，其特征在于：步骤A中，所述从待测淀粉中提取其DNA的特定方法，包括如下步骤：
A-1、称取样品100mg，放入研钵中，加入定量的液氮进行充分地研磨，制成样品粉末；
A-2、将缓冲液GP1放入水浴锅65℃中，进行预热处理，同时加入0.1%浓度体积的巯基乙醇；
A-3、将样品粉末放入经过处理的缓冲液GP1中了，快速地颠倒晃匀，混匀后将离心管迅速地放入水浴锅65℃中，并保持20min，并在这段时间内不断地颠倒晃匀样品；
A-4、把700µL氯仿加入离心管中，颠倒晃匀，并在离心机上以12000转下进行离心，时间为5min；
A-5、离心好后吸取上清液加入另一个的离心管中，同时把700µL缓冲液GP2加入，颠倒晃匀；
A-6、将混...

【专利技术属性】
技术研发人员：周巍，郭楠楠，史国华，张岩，张雅伦，张瑞，李永艳，崔生辉，
申请(专利权)人：河北省食品检验研究院国家果类及农副加工产品质量监督检验中心，河北省食品安全实验室，中国食品药品检定研究院，
类型：发明
国别省市：河北;13