测定虾与蟹中原肌球蛋白的相色谱串联质谱法制造技术

本发明专利技术提供测定虾与蟹中原肌球蛋白的相色谱串联质谱法，涉及测定虾与蟹中原肌球蛋白技术。该测定虾与蟹中原肌球蛋白的相色谱串联质谱法，具体包括以下步骤：S1.前期准备，S2.储配液的配制，S3.丙酮粉的制备，S4.原肌球蛋白的纯化，S5.抗体的制备与鉴定，S6.免疫亲和柱的制备，S7.色谱条件与质谱条件，S8.数据分析，S9.样品提取与净化，S10.蛋白酶水解，S11.基质效应，S12.加标回收率，S13.抗体的制备及特性鉴定，S14.免疫亲和柱柱容量的测定，S15.特征肽段的筛选与合成，S16.流动相及MRM参数优化，S17.方法特异性，S18.基质效应的评价，S19.线性范围、LOD和LOQ，S20.方法的准确度和精密度，S21.实际样品的检测。该方法预处理简单，干扰少，专属性高，准确度和精密度好。准确度和精密度好。准确度和精密度好。

【技术实现步骤摘要】
测定虾与蟹中原肌球蛋白的相色谱串联质谱法


[0001]本专利技术涉及测定虾与蟹中原肌球蛋白
，具体为测定虾与蟹中原肌球蛋白的相色谱串联质谱法。

技术介绍

[0002]食物过敏是免疫球蛋白e介导的对食物蛋白的反应，可导致危及生命的过敏反应，越来越多的研究人员关注食物过敏，因为它对过敏消费者有致命的影响，据报道，5％的成年人和8％的幼儿有食物过敏，而90％以上的食物过敏是由牛奶、花生、鸡蛋、大豆、小麦、坚果、鱼类和甲壳类动物引起的，在食物过敏原列表中，甲壳类是最常见的过敏原，虾、蟹等甲壳类水产品过敏，可出现皮肤红肿、哮喘、鼻炎等过敏性症状，并伴有昏厥、休克甚至危及生命，严重影响过敏人群的健康和生活质量，甲壳类约占所有食物过敏病例的16.1％，原肌球蛋白(TM)是甲壳类动物中的交叉反应过敏原，已被证明是虾、龙虾、螃蟹和南极磷虾等物种的主要过敏原，研究表明，TM序列在不同贝类物种中高度保守，即在不同虾蟹中TM的氨基酸序列存在很大的相似性，不同甲壳类水产品中TM存在共同的表位。
[0003]目前甲壳类产品中TM的检测方法，包括酶联免疫吸附法(ELISA)，量子点基荧光横向流动免疫法(LFIA)，实时聚合酶反应(PCR)，表面等离子体共振(SPR)传感器，荧光夹心生物传感器，核酸适体生物传感器法等，近年来，质谱法因其灵敏度高、准确度高而成功地应用于食品中过敏原的检测，特别是利用高效液相色谱或纳米液相色谱－串联质谱法测定蛋白质消化后的完整蛋白或标志肽，但是现有方法中对虾蟹样品中TM的检测过于复杂，准确度和精密度较低。

技术实现思路

[0004](一)解决的技术问题
[0005]针对现有技术的不足，本专利技术提供了测定虾与蟹中原肌球蛋白的相色谱串联质谱法，解决了现有方法中对虾蟹样品中TM的检测过于复杂，准确度和精密度较低的问题。
[0006](二)技术方案
[0007]为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：测定虾与蟹中原肌球蛋白的相色谱串联质谱法，具体包括以下步骤：
[0008]S1.前期准备
[0009]预备实验所需的材料、试剂和仪器设备。
[0010]S2.储配液的配制
[0011]分别精密称取ANIQLVEK、IVELEEELR、ANIQLVEK适量进行储配液的配制；
[0012]S3.丙酮粉的制备
[0013]将南美白对虾去头、去尾、去虾线进行丙酮粉的制备；
[0014]S4.原肌球蛋白的纯化
[0015]称取丙酮粉溶于BufferB中进行原肌球蛋白的纯化；
[0016]S5.抗体的制备与鉴定
[0017]选取6
‑
8周龄雌性BALB/c小鼠3只制备抗体与鉴定；
[0018]S6.免疫亲和柱的制备
[0019]参照CNBr活化的Sepharose4B胶产品进行免疫亲和柱的制备；
[0020]S7.色谱条件与质谱条件
[0021]进行Easy
‑
nLC1000
‑
OrbitrapFusion色谱及质谱条件和TripleQuad6500
+
液质联用仪色谱及质谱条件；
[0022]S8.数据分析
[0023]利用ThermoProteomeDiscoverer1.4软件对OrbitrapFusion的原始数据进行分析；
[0024]S9.样品提取与净化
[0025]称取0.1g样品，加入10mL超纯水，涡旋振荡1h，取3mL提取液，进行后续平衡、上样、淋洗、洗脱的净化处理；
[0026]S10.蛋白酶水解
[0027]取500μL净化液进行蛋白酶水解；
[0028]S11.基质效应
[0029]将配料不含虾的薯片和鲈鱼作为空白基质，精密移取一定量的特征肽段ANIQLVEK储备液，分别用水和空白基质提取液稀释配制成0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、400nmol/L标准曲线溶液；
[0030]S12.加标回收率
[0031]向空白样品中添加原肌球蛋白纯品进行回收率测定，添加三个浓度：1LOQ、3LOQ、10LOQ；
[0032]S13.抗体的制备及特性鉴定
[0033]采用间接竞争ELISA法评价TM抗体的特性；
[0034]S14.免疫亲和柱柱容量的测定
[0035]为测试自制免疫亲和柱的柱容量，本方法测试了不同载样品的回收率；
[0036]S15.特征肽段的筛选与合成
[0037]将前处理后的样品直接注入Easy
‑
nLC1000
‑
Fushion进行分离分析，将所得的肽段信息利用ProteinPilot软件和Uniprot数据库分析处理，与Uniprot数据库结果比对后，得到多条肽段，最终筛选到2段响应值较好、灵敏度较高的特征肽段：ANIQLVEK、IVELEEELR，合成上述2条特征肽段及内标肽段：ANIQLVEK作为标准样品，进行后续研究；
[0038]S16.流动相及MRM参数优化
[0039]将三段肽段标准品分别用水稀释至1μmol/L进行流动相及MRM参数优化；
[0040]S17.方法特异性
[0041]方法的特异性意味着该方法不受非目标物的干扰，对肽段及加了内标酶解的样品进行检测，考察方法的特异性；
[0042]S18.基质效应的评价
[0043]在质谱分析中必须考虑基质效应，样品基质中其他组分可能会影响分析物的离子化，由于基质组分的共洗脱，分析物的信号抑制或增强可能会影响方法的准确性，基质效应
可能是由复杂的分析样品基质、溶剂、试剂和用于样品制备的材料或流动相中的溶剂、缓冲液和添加剂带来的化合物引起的，提取后添加、柱后注入和校准曲线斜率的比较是评价基质效应的主要方法；
[0044]S19.线性范围、LOD和LOQ
[0045]在不含虾的薯片和鲈鱼的空白基质中，添加混标储备液进行方法的线性范围、LOD和LOQ；
[0046]S20.方法的准确度和精密度
[0047]方法的准确度用加标回收率来表示，每个水平5个平行，精密度用5个平行样品加标回收率的相对标准偏差来表示，选择薯片、鲈鱼为研究对象；
[0048]S21.实际样品的检测
[0049]从当地超市采购的13种样品，包括对虾、虾棒、虾球、蟹棒和鱼丸，确定该方法的适用性。
[0050]优选的，所述S1中材料与试剂具体的为碳酸氢铵、二硫苏糖醇、碘乙酰胺、原肌球蛋白纯品、乙腈、甲酸、胰蛋白酶，其中所有实验用水均为Watsons water，原肌球蛋白两条特征肽段ANIQLVEK、IVELEEELR、ANIQLVEK纯度均≥98％，HAT、HT、福氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、PEG4000、免疫球蛋白亚型试剂盒、细胞培养板、DMEM培养基、HRP标记羊抗小鼠IgG、牛血清白蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.测定虾与蟹中原肌球蛋白的相色谱串联质谱法，其特征在于，具体包括以下步骤：S1.前期准备预备实验所需的材料、试剂和仪器设备。S2.储配液的配制分别精密称取ANIQLVEK、IVELEEELR、ANIQLVEK适量进行储配液的配制；S3.丙酮粉的制备将南美白对虾去头、去尾、去虾线进行丙酮粉的制备；S4.原肌球蛋白的纯化称取丙酮粉溶于BufferB中进行原肌球蛋白的纯化；S5.抗体的制备与鉴定选取6
‑
8周龄雌性BALB/c小鼠3只制备抗体与鉴定；S6.免疫亲和柱的制备参照CNBr活化的Sepharose 4B胶产品进行免疫亲和柱的制备；S7.色谱条件与质谱条件进行Easy
‑
nLC 1000
‑
Orbitrap Fusion色谱及质谱条件和Triple Quad6500
+
液质联用仪色谱及质谱条件；S8.数据分析利用ThermoProteomeDiscoverer1.4软件对OrbitrapFusion的原始数据进行分析；S9.样品提取与净化称取0.1g样品，加入10mL超纯水，涡旋振荡1h，取3mL提取液，进行后续平衡、上样、淋洗、洗脱的净化处理；S10.蛋白酶水解取500μL净化液进行蛋白酶水解；S11.基质效应将配料不含虾的薯片和鲈鱼作为空白基质，精密移取一定量的特征肽段ANIQLVEK储备液，分别用水和空白基质提取液稀释配制成0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、400nmol/L标准曲线溶液；S12.加标回收率向空白样品中添加原肌球蛋白纯品进行回收率测定，添加三个浓度：1LOQ、3LOQ、10LOQ；S13.抗体的制备及特性鉴定采用间接竞争ELISA法评价TM抗体的特性；S14.免疫亲和柱柱容量的测定为测试自制免疫亲和柱的柱容量，本方法测试了不同载样品的回收率；S15.特征肽段的筛选与合成将前处理后的样品直接注入Easy
‑
nLC1000
‑
Fushion进行分离分析，将所得的肽段信息利用ProteinPilot软件和Uniprot数据库分析处理，与Uniprot数据库结果比对后，得到多条肽段，最终筛选到2段响应值较好、灵敏度较高的特征肽段：ANIQLVEK、IVELEEELR，合成上述2条特征肽段及内标肽段：ANIQLVEK作为标准样品，进行后续研究；
S16.流动相及MRM参数优化将三段肽段标准品分别用水稀释至1μmol/L进行流动相及MRM参数优化；S17.方法特异性方法的特异性意味着该方法不受非目标物的干扰，对肽段及加了内标酶解的样品进行检测，考察方法的特异性；S18.基质效应的评价在质谱分析中必须考虑基质效应，样品基质中其他组分可能会影响分析物的离子化，由于基质组分的共洗脱，分析物的信号抑制或增强可能会影响方法的准确性，基质效应可能是由复杂的分析样品基质、溶剂、试剂和用于样品制备的材料或流动相中的溶剂、缓冲液和添加剂带来的化合物引起的，提取后添加、柱后注入和校准曲线斜率的比较是评价基质效应的主要方法；S19.线性范围、LOD和LOQ在不含虾的薯片和鲈鱼的空白基质中，添加混标储备液进行方法的线性范围、LOD和LOQ；S20.方法的准确度和精密度方法的准确度用加标回收率来表示，每个水平5个平行，精密度用5个平行样品加标...

【专利技术属性】
技术研发人员：范素芳，张岩，史国华，王丽明，马俊美，李强，王惠鑫，杨松，
申请(专利权)人：河北省食品检验研究院国家果类及农副加工产品质量监督检验中心，河北省食品安全实验室，
类型：发明
国别省市：