NGS肿瘤基因突变检测降噪方法技术

本发明专利技术公开了NGS肿瘤基因突变检测降噪方法，包括以下步骤：步骤一：提前准备好四个数据库：靶点数据库、人群频率数据库、噪音数据库、STR数据库。靶点数据库的收集主要包括两个方面，一个是从NCCN、FDA、NMPA等机构发布的文档或者其官方文档中整理，另一个是下载Clinvar、OncoKB、Cosmic数据库中致病或可能致病的突变位点。本发明专利技术能够显著降低肿瘤基因检测结果的噪音，呈现真实有效的突变位点，提高肿瘤基因检测的准确性，并降低生信分析人员的时间成本。本。本。

【技术实现步骤摘要】
NGS肿瘤基因突变检测降噪方法


[0001]本专利技术涉及NGS肿瘤基因突变检测
，具体为NGS肿瘤基因突变检测降噪方法。

技术介绍

[0002]高通量基因检测可为肿瘤的临床治疗提供更精准的治疗方案，基因检测结果的准确性至关重要。目前分析肿瘤体细胞突变的常用软件有mutect2、strelka2、varscan等，但这些软件给出的最终结果往往无法直接使用，存在一定的假阳性和假阴性突变。造成假阳性和假阴性的因素较多，主要包括样本局部降解、样本氧化损伤、样本污染、测序仪测序错误、试剂和系统噪音等。
[0003]一个肿瘤样本通常有几十甚至上百个候选突变位点，其中大部分为假阳性突变。这些候选位点的真假判定，需要生信分析人员掌握非常丰富的经验，而且耗费大量的人力和时间成本。
[0004]本专利技术针对以上提到的可能造成假阳性和假阴性突变的众多因素，依次进行降噪过滤和验证，实现自动化和流程化，最终呈现真实有效的突变。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供NGS肿瘤基因突变检测降噪方法，解决了
技术介绍
中所提出的问题。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：NGS肿瘤基因突变检测降噪方法，包括以下步骤：
[0007]步骤一：提前准备好四个数据库：靶点数据库、人群频率数据库、噪音数据库、STR数据库。靶点数据库的收集主要包括两个方面，一个是从NCCN、FDA、NMPA等机构发布的文档或者其官方文档中整理，另一个是下载Clinvar、OncoKB、Cosmic数据库中致病或可能致病的突变位点(不包含短串联重复区域的突变)，最后编写脚本(python/R等编程语言)将这两部分的突变位点合并，并以HGVS规则进行注释，以ghgvs作为每个突变位点的标签。人群频率数据库的准备，需要下载dbsnp、千人基因组、gnomAD、ExAC等数据库的VCF文件，编写脚本提取人群频率大于千分之一(只要有一个数据库满足条件即可)的突变位点，同样以ghgvs作为每个突变位点的标签。噪音数据库依赖本地已分析的肿瘤样本数据，样本数量越多越好。其中高频出现(大于1％)的非致病突变位点，按照突变丰度的波动范围(突变丰度的最小值到最大值)进行分类，一般胚系突变的波动范围在40％～60％或者90％～100％，试剂和系统噪音突变一般在0～5％或者在某个恒定的值(如某个噪音突变在收录的肿瘤样本中都以20％左右的突变丰度出现)。把这两部分突变整理合并，并同样以ghgvs作为每个突变位点的标签。STR数据库，编程提取人类基因组或某个bed区间内STR(短串联重复)区域重复单元的插入或缺失突变，同样以ghgvs作为每个突变位点的标签；
[0008]步骤二：复杂位点合并：这里以一个复杂的EGFR 19del突变举例，mutect2等分析
软件分析出chr7:g.55242469_55242477del和chr7:g.55242478G>C这两个突变，这两个突变的丰度都在32％左右，而且通过查看bam文件，这两个突变发生在相同的reads上，所有这两个突变其实是一个复杂突变，需要将其合并，最终合并成chr7:g.55242469_55242478delinsC；
[0009]步骤三：假阳性过滤：这一步主要包含UMI过滤、链偏好性过滤、突变单元分布过滤、非致病位点过滤、噪音过滤五个小步骤。UMI过滤：用samtools工具从原始的bam文件中提取每个突变位点上下游各250bp范围的所有reads，对各个reads的UMI进行统计，最终统计出每个UMI所拥有的reads数(筛选大于等于2个reads支持的UMI，短串联重复区域突变的阈值提高到3)，及其在突变reads和未突变reads中的比例(过滤同时出现在未突变reads中的UMI)，筛选后的UMI数大于等于3的突变位点可以保留。链偏好性过滤：mutect2等软件一般也有这方面的过滤，只是mutect2的过滤过于严苛，很多时候会过滤掉真实突变。本专利技术的方法是把mutect2分析结果中的SB值提取出来，再用R语言中的fisher.test函数计算链偏好性p值，过滤p值小于0.05的突变位点。突变单元分布过滤：以突变位点为中心，左右各延伸10bp，把这段长约20bp的片段命名为突变单元。再用samtools从原始的bam文件中提取突变位点上下游各250bp的所有reads，突变单元在这些reads中的位置应该是从左到右随机分布的，过滤掉分布异常的突变位点，比如突变单元全部集中在reads的左端或者右端。非致病位点过滤：对mutect2分析结果的位点进行注释(如annovar/snpeff/vep等注释软件)过滤掉位于基因间区、内含子非剪切区域、UTR区域的突变位点；过滤提前准备好的人群频率数据库中的突变位点；过滤突变丰度低于百分之一且不在靶点数据库中的突变位点。噪音过滤：过滤噪音数据库中的突变位点，过滤位于STR数据库中且突变丰度较低的突变位点。其中，STR区域位点的过滤，还要结合肿瘤类型，MSI状态，肿瘤样本中其它致病突变的丰度等多个因素进行综合考量，如某个MSI
‑
H的结直肠癌患者，有几个高丰度(如30％左右)的MSH2基因移码突变，还有其它基因STR区域丰度较低(5％左右)的移码突变，这些低丰度的移码突变就有很大可能是真的，具体还要再看UMI的质控和突变单元的分布情况；
[0010]步骤四：靶点回捞：靶点数据库中的突变位点，如果不在此次检测结果中，则用samtools工具从原始的bam文件中提取对应坐标上下游250bp的所有reads，验证是否有该突变，以防低频的真实突变被分析软件因为样本降解、丰度太低、背景噪音过多而过滤掉。
[0011]作为本专利技术的一种优选实施方式，所述步骤一中的靶点数据库准备，收集NCCN、FDA、NMPA等机构推荐或获批的靶向药物相关突变位点；Clinvar、OncoKB、Cosmic等数据库中致病或可能致病的突变位点，需要提取原始的bam文件再次进行验证，以防低频的真实突变被分析软件过滤掉。
[0012]作为本专利技术的一种优选实施方式，所述步骤一中的人群频率数据库准备，收集整理dbsnp、千人基因组、gnomAD、ExAC等数据库中，人群频率大于千分之一的突变位点。
[0013]作为本专利技术的一种优选实施方式，所述步骤一中的噪音数据库准备，整理本地肿瘤数据库中高频出现的非致病突变位点，按照突变丰度的波动范围进行分类，挑出胚系突变、试剂和系统噪音突变，把这部分突变归类为噪音突变，后续直接过滤掉这部分突变位点。
[0014]作为本专利技术的一种优选实施方式，所述步骤一中的STR数据库准备，收集人类基因组中STR(短串联重复)区域重复单元的插入或缺失突变，这部分突变在肿瘤样本中大部分
是滑链错配导致的低频噪音，少部分是真实突变(如结直肠癌的MSI
‑
H患者)，这部分突变不能直接按照噪音过滤掉，而要根据肿瘤类型、突变丰度等多个指标进行综合判断。
[0015]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.NGS肿瘤基因突变检测降噪方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一：提前准备好四个数据库：靶点数据库、人群频率数据库、噪音数据库、STR数据库。靶点数据库的收集主要包括两个方面，一个是从NCCN、FDA、NMPA等机构发布的文档或者其官方文档中整理，另一个是下载Clinvar、OncoKB、Cosmic数据库中致病或可能致病的突变位点(不包含短串联重复区域的突变)，最后编写脚本(python/R等编程语言)将这两部分的突变位点合并，并以HGVS规则进行注释，以ghgvs作为每个突变位点的标签。人群频率数据库的准备，需要下载dbsnp、千人基因组、gnomAD、ExAC等数据库的VCF文件，编写脚本提取人群频率大于千分之一(只要有一个数据库满足条件即可)的突变位点，同样以ghgvs作为每个突变位点的标签。噪音数据库依赖本地已分析的肿瘤样本数据，样本数量越多越好。其中高频出现(大于1％)的非致病突变位点，按照突变丰度的波动范围(突变丰度的最小值到最大值)进行分类，一般胚系突变的波动范围在40％～60％或者90％～100％，试剂和系统噪音突变一般在0～5％或者在某个恒定的值(如某个噪音突变在收录的肿瘤样本中都以20％左右的突变丰度出现)。把这两部分突变整理合并，并同样以ghgvs作为每个突变位点的标签。STR数据库，编程提取人类基因组或某个bed区间内STR(短串联重复)区域重复单元的插入或缺失突变，同样以ghgvs作为每个突变位点的标签；步骤二：复杂位点合并：这里以一个复杂的EGFR 19del突变举例，mutect2等分析软件分析出chr7:g.55242469_55242477del和chr7:g.55242478G>C这两个突变，这两个突变的丰度都在32％左右，而且通过查看bam文件，这两个突变发生在相同的reads上，所有这两个突变其实是一个复杂突变，需要将其合并，最终合并成chr7:g.55242469_55242478delinsC；步骤三：假阳性过滤：这一步主要包含UMI过滤、链偏好性过滤、突变单元分布过滤、非致病位点过滤、噪音过滤五个小步骤。UMI过滤：用samtools工具从原始的bam文件中提取每个突变位点上下游各250bp范围的所有reads，对各个reads的UMI进行统计，最终统计出每个UMI所拥有的reads数(筛选大于等于2个reads支持的UMI，短串联重复区域突变的阈值提高到3)，及其在突变reads和未突变reads中的比例(过滤同时出现在未突变reads中的UMI)，筛选后的UMI数大于等于3的突变位点可以保留。链偏好性过滤：mutect2等软件一般也有这方面的过滤，只是mutect2的过滤过于严苛，很多时候会过滤掉真实突变。本发明的方法是把mutect2分析结果中的SB值提取出来，再用R语言中的fisher.test函数计算链偏好性p值，过滤p值小于0.05的突变位点。突变单元分布过滤：以突变位点为中心，左右各延伸10bp，把这段长约20bp的片段命名为突变单元。再用samtools从原始的bam文件中提取突变位点上下游各250bp的所有reads，突变单元在这些reads中的位置应该是从左到右随机分布的，过滤掉分布异常的突变位点，比如突变单元全部集中在reads的左端或者右端。非致病位点过滤：对mutect2分析结果的位点进行注释(如annovar/snpeff/vep等注释软件)过滤掉位于基因间区、内含子非剪切区域、UTR区域的突变位点；过滤提前准备好的人群频率数据库中的突变位点；过滤突变丰度低于百分之一且不在靶点数据库中的突变位点。噪音过滤：过滤噪音数据库中的突变位点，过滤位于STR数据库中且突变丰度较低的突变位点。其中，STR区域位点的过滤，还要结合肿瘤类型，MSI状态，肿瘤样本中其它致病突变的丰度等多个因素进行综合考量，如某个MSI
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H的结直肠癌患者，有几个高丰度(如30％左右)的MSH2基因移码突变，还有其它基因STR区域丰度较低(5％左右)的移码突变，这些低丰度的
移码突变就有很...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄松林，张惠丹，
申请(专利权)人：苏州绘真医学检验有限公司，
类型：发明
国别省市：