基于酶DNA修复级联驱动荧光团编码/去编码的生物传感器及其在端粒酶检测中的应用制造技术

本发明专利技术提供基于酶DNA修复级联驱动荧光团编码/去编码的生物传感器及其在端粒酶检测中的应用，属于荧光检测技术领域。所述生物传感器至少包括AP探针，TS引物，无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶(APE1)，荧光基团修饰的dATP，末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)以及链霉亲和素包被的磁珠。采用本发明专利技术生物传感器进行端粒酶检测，可以有效防止非特异性扩展，降低背景信号，使用基于全内反射荧光(TIRF)的单分子检测进行定量，可以实现在单细胞水平灵敏检测端粒酶，从而使其在早期临床诊断和抗癌药物开发等方面具有巨大潜力，因此具有良好的实际应用之价值。值。值。

【技术实现步骤摘要】
基于酶DNA修复级联驱动荧光团编码/去编码的生物传感器及其在端粒酶检测中的应用


[0001]本专利技术属于荧光检测
，具体涉及基于酶DNA修复级联驱动荧光团编码/去编码的生物传感器及其在端粒酶检测中的应用。

技术介绍

[0002]本专利技术
技术介绍
中公开的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]端粒是位于染色体末端的特殊的非编码串联DNA重复序列(TTAGGG)n结构，随着细胞的分裂逐渐缩短，会导致基因组不稳定和细胞衰老。人类端粒酶是一种重要的核糖核蛋白，通过在端粒的3
′
端添加端粒重复序列5
‑
(TTAGGG)n来维持端粒长度和细胞分裂潜能。端粒酶由人端粒酶RNA(hTER)、端粒酶相关蛋白(hTEP1)和人端粒酶逆转录酶(hTERT)组成，其中hTERT在端粒酶的合成功能中起着决定性作用，是端粒酶活性的限制因素。在大多数人体细胞中，端粒酶的表达水平极低，但是在癌细胞中，例如胃癌、肺癌和肝癌等超过85％的癌细胞，端粒酶具有很高的表达，由于端粒酶活性在正常体细胞和癌细胞之间存在显著差异，端粒酶已被视为早期癌症诊断和预测的重要生物标志物。同时，随着端粒酶抑制剂和靶向抗癌剂的发展，抑制端粒酶活性被认为是一种很有前途的癌症治疗方法。因此，准确、快速、灵敏地检测端粒酶活性对生物医学研究、临床诊断和癌症治疗具有重要意义。
[0004]近几十年来，端粒酶检测方法层出不穷，其中最经典的方法是基于聚合酶链反应(PCR)的端粒重复序列扩增方案(TRAP)，它广泛用于端粒酶活性的高灵敏度检测。然而，这个经典的方法具有程序复杂、聚合酶活性受到细胞提取物的干扰以及无法避免的产生非特异性扩增的缺点。
[0005]为了优化复杂的实验程序，人们开发出了一些比经典方法更简单的检测端粒酶的方法，如：基于DNA镊子的荧光法、基于链位移的比率荧光法、基于氧化石墨烯的荧光法和基于单分散金纳米棒的电化学生物传感器。这些方法不仅能够更加快速简便的检测端粒酶，而且一些方法还具有能够确定端粒酶反应产物长度分布或同时检测端粒酶和其他生物标记物的优势。然而，这些分析方法涉及繁琐的纳米材料合成、复杂的探针设计，并且由于缺乏信号放大过程，因此这些方法的灵敏度不令人满意。
[0006]为了提高灵敏度，人们开发出了一系列与信号放大策略相结合的方法，如：催化发夹组装(CHA)、指数等温扩增反应(EXPAR)、核酸外切酶辅助信号扩增(EASA)、滚环扩增(RCA)和杂交链式反应(HCR)。这些方法改善了之前方法所存在的不足，具有良好的灵敏度和特异性，但是这些方法依赖于严格的序列要求、温和的反应条件和复杂的表面改性过程。此外，值得注意的是聚合酶链反应(PCR)、滚环扩增(RCA)、指数等温扩增反应(EXPAR)是模板依赖性扩增，而核酸外切酶辅助信号扩增(EASA)、催化发夹组装(CHA)以及杂交链式反应(HCR)依赖于DNA探针序列，它们的扩增过程也表现出模板依赖性，这导致非特异性扩增产
生的扩增子交叉污染产生不可避免的假阳性信号。因此，开发一种用于端粒酶检测的具有高灵敏度和低模板依赖性的简单信号放大分析方法成为本领域研究人员亟待解决的问题。

技术实现思路

[0007]针对现有技术中的不足，本专利技术提供一种基于酶DNA修复级联驱动荧光团编码/去编码的生物传感器及其在端粒酶检测中的应用。本专利技术基于端粒定向级联DNA修复介导的荧光团编码/解码，开发一种用于敏感检测端粒酶的模板独立的生物传感器以及相应单分子分析方法，从而有效防止非特异性扩展，降低背景信号，使用基于全内反射荧光(TIRF)的单分子检测进行定量，从而可以实现在单细胞水平灵敏检测端粒酶，因此具有良好的实际应用之价值。
[0008]为实现上述技术目的，本专利技术的技术方案如下：
[0009]本专利技术的第一个方面，提供一种基于酶DNA修复级联驱动荧光团编码/去编码的生物传感器，所述生物传感器至少包括AP探针，TS引物，无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶(APE1)，荧光基团修饰的dATP，末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)以及链霉亲和素包被磁珠；
[0010]其中，所述AP探针为一个单链的DNA，所述AP探针含有无嘌呤/无嘧啶(AP)位点，并位于AP探针核苷酸序列中间；
[0011]进一步的，所述AP探针5'末端和3'末端分别修饰有生物素和磷酸基团；
[0012]同时，所述AP探针可以与端粒酶延伸产物(TRPs)完全杂交形成包含AP位点的双链DNA，而与未能发生反应的TS引物只会部分杂交。
[0013]所述TS引物能够被端粒酶快速识别，并催化将重复序列5
‑
(TTAGGG)n添加到TS引物的3'端，产生端粒酶延伸产物(TRPs)。
[0014]所述无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶(APE1)是一种通过随机序列水解双链DNA(dsDNA)中的DNA磷酸二酯骨架来切割AP位点的核酸内切酶，其能够特异性识别和切割与所述AP探针与端粒酶延伸产物(TRPs)完全杂交所形成的双链DNA上的AP位点，而对于未反应的TS引物与所述AP探针部分杂交形成的双链DNA只表现出极低的活性；则APE1特异性识别和切割双链DNA中的AP位点，在5'和3'端分别产生一个含有生物素和羟基的短单链DNA。随后，通过添加链霉亲和素包被磁珠(MBs)，MBs通过生物素和链霉亲和素之间的强非共价键捕获具有游离3'
‑
OH末端的短ssDNA，然后通过磁分离去除未结合的寡核苷酸，生成MB短ssDNA复合物；随后，TdT可以催化将dATP和荧光基团修饰的dATP添加到ssDNA的3'
‑
OH中，在MBs表面形成荧光基团标记的长ssDNA，随后通过磁分离从反应溶液中分离，以去除所有多余的荧光基团修饰的dATP。
[0015]其中，所述荧光基团修饰的dATP中，荧光基团不做具体限定，在本专利技术的一个具体实施方式中，所述荧光基团可以为Cy5。
[0016]进一步的，所述Cy5 dATPs在总dATPs中占比少于50％，进一步少于30％，优选为20％，这样Cy5 dATPs可以更加高效地延伸至磁珠所捕获短单链DNA的3'
‑
OH末端使得后面荧光信号更加明显，信噪比得到很大的提高。
[0017]同时，本专利技术中采用链霉亲和素包被磁珠进行捕获，商业化的链霉亲和素涂层生物相容性磁珠避免了复杂的表面修饰过程，磁选过程消除了所有干扰(如：细胞提取物、缓冲液和酶等上一步可能影响后续反应中酶活性的步骤)，提供最佳的酶反应环境，有效降低
背景荧光。
[0018]末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)是负责基因组链断裂修复的核内聚合酶，并且能够以无模板的方式催化随机核苷酸并入单链DNA(ssDNA)链的游离3
′‑
羟基(OH)末端。TdT扩增不需要模板，而且被切开的所述5'端带生物素的探针有3'...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于酶DNA修复级联驱动荧光团编码/去编码的生物传感器，其特征在于，所述生物传感器至少包括AP探针，TS引物，无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶，荧光基团修饰的dATP，末端脱氧核苷酸转移酶以及链霉亲和素包被的磁珠；其中，所述AP探针为一个单链的DNA，所述AP探针含有无嘌呤/无嘧啶位点；且所述AP探针可以与端粒酶延伸产物完全杂交形成包含AP位点的双链DNA，而与未能发生反应的TS引物只会部分杂交。2.如权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述AP探针5'末端和3'末端分别修饰有生物素和磷酸基团；优选的，所述AP探针长度为30nt，所述AP探针的碱基序列为:5'
‑
Biotin
‑
CCTCCC TAAXCC TAA CTC TGC TCG ACG GAT
‑
PO4‑
3'，其中下划线标出的碱基序列即为磁珠捕获的后续进行TdT扩增的序列，下划线标出的X即无嘌呤/无嘧啶位点。3.如权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述荧光基团修饰的dATP中，所述荧光基团为Cy5；优选的，所述Cy5 dATPs在总dATPs中占比少于50％，进一步少于30％，优选为20％。4.如权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述生物传感器还包括核酸外切酶，优选为核酸外切酶I。5.权利要求1
‑
4任一项所述生物传感器在检测端粒酶中的应用。6.一种检测端粒酶的方法，其特征在于，所述方法包括采用权利要求1
‑
4任一项所述生物传感器进行检测。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括：S1、将待测样品加入反应溶液I中，进行端粒酶延伸以及酶切反应，然后高温灭活处理并进行磁珠捕获，构建MB单链DNA纳米结构；S2、向步骤S1制得的MB单链DNA纳米结构中加入TdT酶，dATPs和荧...

【专利技术属性】
技术研发人员：张春阳，刘明昊，于宛彤，
申请(专利权)人：山东师范大学，
类型：发明
国别省市：