鸡mtDNA D-loop区全序列扩增及测序方法和专用引物技术

本发明专利技术公开了一种鸡mtDNA D-loop区全序列扩增及测序方法和专用引物，属于鸡线粒体基因组研究领域。鸡mtDNA D-loop区全序列扩增及测序用引物，见序列表SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3。扩增及测序方法，包括以下步骤：（1）提取鸡羽毛中的DNA，并检测质量；（2）在鸡mtDNA D-loop区上下游保守区域设计一对PCR引物（见序列表SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2），通过PCR反应扩增包含Cytb基因的片段，经琼脂糖电泳检测；（3）设计测序引物（见序列表SEQ ID NO.3）对PCR产物进行测序；（4）对测序序列进行拼接。本发明专利技术的检测方法具有速度快、成本低、易掌握等优点，所获得的mtDNA D-loop区全序列可以应用于鸡遗传资源多样性评估、母系起源、系统进化分析和种质资源鉴定与保护等多个领域。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学
，尤其涉及一种鸡mtDNAD-loop全序列扩增及其测序方法。
技术介绍
动物遗传资源多样性能够为品种改良提供素材，并且能够很好适应环境的变化。我国有丰富家禽地方品种资源，研究和评估我国家禽地方品种的遗传多样性，制定合理的利用和保护措施对我国畜牧业的可持续发展具有重要意义。研究动物遗传多样性的方法主要有微卫星和线粒体DNA等，两种方法各有优缺点，线粒体DNA更容易操作。畜(禽)品种大都受到外来公畜(禽)杂交改良的影响，群体数量减少甚至消失，给研究品种起源和多样性带来很大困难。线粒体DNA在遗传过程中，遗传物质通过卵细胞质传递，较少发生DNA重组，其野生祖先的线粒体DNA类型一般能得以保持。这种遗传方式，一个个体就能代表一个母性集团，因此只需少量个体样本便能反映一个群体的遗传结构。研究者可以从复杂的遗传背景中分辨不连续的母系血统，即使经过几千年的杂交繁育，系统关系依然明晰。鸡线粒体基因组一般在16785bp左右，为闭合环状双链结构，能够自主复制和转录。包括37个基因的编码编码区(13个蛋白质编码基因、2个核糖体RNA基因、22个转运RNA基因)和1个控制区(D-loop)。D-loop区为mtDNA上最重要的非编码区，进化速率较编码区更快，是适合亲缘关系较近的群体进行遗传分化研究的理想分子标记。D-loop区部分或者全部序列已经广泛地应用于动物类群的遗传多样和系统进化研究中。国内外虽然已经有人用D-loop区高变区进行鸡遗传多样性和亲缘进化的研究，但是全序列包含的遗传信息更为丰富，目前还没有运用D-loop区全序列对我国家禽地方品种进行系统的研究，因此建立mtDNAD-loop区全序列扩增和测序方法是十分必要的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提出一种鸡mtDNAD-loop区全序列的扩增及测序方法和专用引物，本专利技术速度快、成本低、易于掌握，能够有效检测出鸡的mtDNAD-loop区全序列。本专利技术提供了一种鸡mtDNAD-loop区全序列扩增及测序用引物，包括PCR引物和测序引物，所述PCR引物的上游引物:5'-AAACACCCAAACTCACTAAC-3'，PCR引物的下游引物:5'-CACTGGGATGCGGATACTTGC-3'；所述测序引物：5'-GCAACCCCTGCCTGTAAT-3'。本专利技术还提供了一种鸡mtDNAD-loop区全序列扩增及测序方法，包括以下步骤：(1)提取鸡羽毛中的DNA，并检测质量。(2)根据红色原鸡mtDNAD-loop区在mtDNA全基因组序列上的相对位置，在mtDNAD-loop区上下游保守区域设计一对PCR引物，PCR引物引物序列为：Forwardprime(SEQIDNO.1):5'-AAACACCCAAACTCACTAAC-3'Reverseprimer(SEQIDNO.2):5'-CACTGGGATGCGGATACTTGC-3'(3)PCR产物测序与序列拼接通过PCR反应，获得目的片段，纯化后送测序公司测序，由于mtDNAD-loop区下游结构复杂，反向引物无法测出，根据正向引物已测出的mtDNAD-loop区序列设计一条测序引物，进行引物步移(Primerwalking)测序，然后将正向引物和步移引物测得两条序列进行拼接，获得mtDNAD-loop区全序列。测序引物Walkingprimer(SEQIDNO.3)为5'-GCAACCCCTGCCTGTAAT-3'。步骤1中鸡羽毛中DNA的提取步骤为：羽毛样采集雏鸡或者成鸡换羽后刚长出的羽毛，一般为2-3根，用剪刀剪掉羽根上部的绒羽，在干净的PE手套上剪碎后，放入2mL离心管中，每个样品加入裂解液1000μL及蛋白酶K40μL摇匀，放摇床内59℃水浴消化。消化充分后，加700-800uL饱和酚，摇匀10min后以转速10000rpm离心5min。吸取上清液放入2mL离心管中，加1000uL饱和酚，摇匀5min后以转速10000rpm离心5min。吸取上清液放入2mL离心管中，加氯仿1000uL，摇匀5min后以转速10000rpm离心5min。吸取上清液放入2mL离心管中，加无水乙醇沉淀出DNA团块，留下DNA倒掉乙醇，再把DNA团块用70％的酒精洗一遍，以转速10000rpm离心10min。倒掉乙醇，留下DNA，凉干(1h)，加灭菌水100uL溶解，放-20℃冰箱保存。步骤3中PCR反应体系为：PCRMix25μL，10μmol/L引物各1.5μL，模板2μL，灭菌水20μL。步骤3中PCR反应程序为：95℃5min，(95℃30s，55℃30s，72℃60s)30循环，72℃4min。步骤3中所述mtDNAD-loop区拼接方法为将测序得到的序列经DNAStar5.02软件的SeqMan程序拼接。拼接序列与GenBank中红色原鸡参考序列NC_007235进行比对，剪掉引物及多余的序列。上述的方法，所述PCR扩增特异性条带为1635bp，包含mtDNAD-loop区全序列及上下游部分序列，其核苷酸序列为：(大写字母表示上游和下游序列，黑色下划线表示上下游引物位置，阴影部分表示步移引物位置)：aattttattttttaacctaactccc240ctactaagtgtaccccccctttcccccccagggggggtatactatgcataatcgtgcata300catttatataccacatatattatggtaccggtaatatatactatatatgtactaaaccca360ttatatgtatacgggcattaatctatattccacatttctcccaatgtccattctatgcat420gatccaggacatacccattcaccctccccatagacagctccaaaccactaccaagtcacc480taactatgaatggttacaggacataaatctcactcttatgctcttcccccaacaagtcac540ctaactatgaatggttacaggacatacatttaactaccatgttctaacccatttggttat600gctcgacgtatcagatggatttattgatcgtccacctcacgagagatcagtacttcatgaccagtctcaggcccattctttccccctacacccctcgcccta720cttgccttccaccgtacctctggttcctcggtcaggcacatcccatgcataactcctgaa780ct本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鸡mtDNA D‑loop区全序列扩增及测序用引物，其特征是，所述引物包括PCR引物和测序引物，所述PCR引物的上游引物:5'‑AAACACCCAAACTCACTAAC‑3'，PCR引物的下游引物:5'‑CACTGGGATGCGGATACTTGC‑3'；所述测序引物：5'‑GCAACCCCTGCCTGTAAT‑3'。

【技术特征摘要】
1.一种鸡mtDNAD-loop区全序列扩增及测序用引物，其特征是，所述引物包括PCR引
物和测序引物，所述PCR引物的上游引物:5'-AAACACCCAAACTCACTAAC-3'，PCR引物
的下游引物:5'-CACTGGGATGCGGATACTTGC-3'；
所述测序引物：5'-GCAACCCCTGCCTGTAAT-3'。
2.一种鸡mtDNAD-loop区全序列扩增及测序方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取鸡羽毛中的DNA，并检测质量；
(2)在鸡mtDNAD-loop区上下游保守区域设计一对权利要求1所述的PCR引物，通过
PCR反应扩增包含Cytb基因的片段，经琼脂糖电泳检测；
(3)利用权利要求1所述的测序引物对步骤(2)中所述PCR扩增产物进行测序；
(4)对测序获得序列进行拼接，并减掉上下游多余的序列，获得鸡mtDNAD-loop区全
序列，鸡mtDNAD-loop区全长为1231-1232bp。
3.根据权利要求2所述的鸡mtDNAD-loop区全序列扩增及测序方法，其特征在于，所
述用于扩增鸡mtDNAD-loop区全序列的PCR反应体系为：PCRMix25μL，10μmol/LPCR
引物的上、下游引物各1.5μL，模板2μL，灭菌水20μL。
4.根据权利要求2或3所述的鸡mtDNAD-loop区全序列扩增及测序方法，其特征在于，
所述用于扩增鸡mtDNAD-loop区全序列的PCR反应程序为：95℃5min；95℃30s，55℃
30s，72℃60s，30个循环；72℃4min。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的鸡基因组DNA模板制作方法如下：
所述羽毛样采集雏鸡或者成鸡换羽后刚长出的羽毛2-3根，剪掉羽根上部的绒羽，剪碎后的
羽毛放入2mL离心管中，每个羽毛样品加入裂解液1000μL及蛋白酶K40μL摇匀，放摇床
内59℃水浴消化；
消化充分后，加700-800uL饱和酚，摇匀10min后以转速10000rpm离心5min；
吸取上清液放入2mL离心管中，加1000uL饱和酚，摇匀5min后以转速10000rpm离
心5min；
吸取上清液放入2mL离心管中，加氯仿1000uL，摇匀5min后以转速10000rpm离心5
min；
吸取上清液放入2mL离心管中，加无水乙醇沉淀出DNA团块，留下DNA倒掉乙醇，
再把DNA团块用70％的酒精洗一遍，以转速10000rpm离心10min；倒掉乙醇，留下DNA，
凉干1h，加灭菌水100uL溶解，于-20℃保存。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述mtDNAD-loop拼接方

\t法为：将步骤3所述测序获得序列经DNAStar5.02软件的SeqMan程序拼接，将拼接序列
与GenBank中红色原鸡参考序列NC_007235进行比对，剪掉引物及多余的序列，获得鸡
mtDNAD-loop区全序列。
7.根据权利要求2所述的鸡mtDNAD-loop区全序列扩增及测序方法，其特征是，测序
获得包含鸡mtDNAD-loop区全长及上下游部分序列的1635bp的特异性扩增条带的核苷酸
序列为：
AAACACCCAAACTCACTAACCACCCGCATCCTATCACAGACGCTACCACCAACCCCACCA60
CCCCATAATACGGCGAAGGATTAGACGCCACAGCTAAAACCCCCAGCATAAAACAAATCC120
CAAGAAAAATCACAAAATAAGTCATATTATTCCCGCTTGGTTAGACCCCAAGGACTACGG180
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【专利技术属性】
技术研发人员：高玉时，唐修君，贾晓旭，陆俊贤，陈大伟，葛庆联，顾荣，刘茵茵，
申请(专利权)人：江苏省家禽科学研究所，
类型：发明
国别省市：江苏;32