石竹花色调控关键酶基因CHS沉默体系的建立方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种石竹花色调控关键酶基因CHS沉默体系的建立方法及应用，从石竹幼苗叶片中提取mRNA，以反转录的cDNA为模板，根据香石竹CHS基因的保守序列设计引物，通过RT‑PCR采用所设计的引物进行扩增，获得407bp的扩增产物；获得的407bp大小的片段连接到pGEM T‑easy上，得CHS片段；将连接到载体pGEM T‑easy上的CHS片段用EcoRI酶切后连接到采用同样酶切后的TRV2载体上，得重组质粒pTRV2/DcCHS407；将所得的重组质粒pTRV2/CHS407转化GV3101农杆菌。本发明专利技术可以快速、有效的验证花色基因功能，侵染中国石竹花蕾后获得相应性状。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及花卉生物
，具体涉及一种石竹花色调控关键酶基因CHS沉默体系的建立方法和应用。
技术介绍
石竹为石竹科石竹属植物，原产于中国，由于其花色众多，因此在花坛、地被等中广泛应用。研究石竹花色调控机理，获得相关基因，用于同属植物花色遗传改良，增加北方园林用植物种类，达到美化环境的目的。石竹从播种到开花需2-3个月，因此对控制这些花色的基因功能进行快速、有效验证，对今后石竹属植物花色遗传、育种的研究及应用具有重要意义。VIGS(virus-inducedgenesilence，VIGS)技术已应用于多种植物进行基因功能验证，如何利用该技术研究石竹花色基因目前尚无报道。石竹从播种到开花需2-3个月，如何快速鉴定花色基因，获得其功能是目前花色研究中面临的问题。基于此本专利技术建立了一套快速、有效的花色鉴定体系，可以解决验证石竹花色基因功能的问题。查尔酮合成酶(chalconesynthase，CHS)是花色素合成途径中的一个关键酶，它在植物中表达量的改变可能影响花的颜色。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种石竹花色调控关键酶基因CHS沉默体系的建立方法和应用，根据查尔酮合成酶的编码基因序列设计特异引物，通过RT-PCR在石竹中扩增出407bp的cDNA片段，将获得的CHScDNA片段连接到TRV2上，通过优化试验材料、侵染后培养温度等条件，根据花瓣出现的性状，建立了一套快速、有效的验证花色基因功能的体系，有效解决了目前验证石竹花色基因功能时间长的问题。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：石竹花色调控关键酶基因CHS沉默体系的建立方法，包括如下步骤：S1、从石竹幼苗叶片中提取mRNA，以反转录的cDNA为模板，根据香石竹CHS基因的保守序列设计引物，通过RT-PCR采用Forward：GTCGCTTCATGCTCTACCAAC及Reverse：GCTAGGACTGAACGCATCCTC进行扩增，获得407bp的扩增产物；S2、将获得的407bp大小的片段连接到pGEMT-easy上，得CHS片段；S3、将连接到载体pGEMT-easy上的CHS片段用EcoRI酶切后连接到采用同样酶切后的TRV2载体上，得重组质粒pTRV2/DcCHS407；S4、将所得的重组质粒pTRV2/CHS407转化GV3101农杆菌，得含有重组质粒的农杆菌。所述步骤S4具体包括如下步骤：将含重组质粒pTRV2/CHS407的离心管置于液氮中速冻1min后快速置于37℃水浴锅中放置3min，再置于冰上，加入1mlLB液体培养基，在28℃160-200rpm振荡培养3-5h，将菌液取100μl涂在含有Rif和kana的LB平板上，29℃倒置培养2d至出现单菌落，单菌落经PCR检测后，摇菌扩繁、保存，得含有重组质粒的农杆菌。上述石竹花色调控关键酶基因CHS沉默体系的应用具体包括如下步骤：室温下将含有重组质粒的农杆菌在渗透缓冲液中活化4h后，对处于不同发育时期的花蕾进行高压法侵染，待苞片出现水渍状时，表明侵染完成.优选地，将侵染后的生长中期的花蕾在15℃、光照强度为50-72μmol·m-2·s-1的条件下于光照培养箱中培养4d后，花蕾开放，花色改变。优选地，所述渗透缓冲液由10mMMES，10mMMgCl2和40μM乙酰丁香酮组成。本专利技术具有以下有益效果：根据查尔酮合成酶的编码基因序列设计特异引物，通过RT-PCR在石竹中扩增出407bp的cDNA片段，将获得的CHScDNA片段连接到TRV2上，通过优化试验材料、侵染后培养温度等条件，根据花瓣出现的性状，建立了一套快速、有效的验证花色基因功能的体系，有效解决了目前验证石竹花色基因功能时间长的问题；可以有效、大量、快速的鉴定调控中国石竹花色的新基因的功能，如花色、花香、花期等基因的功能。附图说明图1为本专利技术实施例中CHS基因的RT-PCR扩增结果；图中1，2为已扩增的407bp大小的片段。图2为本专利技术实施例中香石竹、瞿麦及石竹CHS核苷酸水平同源性比较示意图。图3为本专利技术实施例中pTRV2/CHS407的酶切结果；图中，M为100bpLadder。具体实施方式为了使本专利技术的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术实施例提供了一种石竹花色调控关键酶基因CHS沉默体系的建立方法，包括如下步骤：S1、从石竹幼苗叶片中提取mRNA，以反转录的cDNA为模板，根据香石竹CHS基因的保守序列设计引物，通过RT-PCR采用Forward：GTCGCTTCATGCTCTACCAAC及Reverse：GCTAGGACTGAACGCATCCTC进行扩增，获得407bp的扩增产物(图1)S2、将获得的407bp大小的片段连接到pGEMT-easy上测序并在NCBI上进行序列比对(图2)。结果表明扩增的片段与瞿麦、香石竹的CHS基因分别达100％和97％的同源性。S3、将连接到载体pGEMT-easy上的CHS片段用EcoRI酶切后连接到采用同样酶切后的TRV2载体上，然后对重组质粒pTRV2/DcCHS407进行酶切验证(图3)；将不同时期的花蕾采下后插入液体培养基(1/2×MS大量元素，1/2×MS钙盐，1×MS微量元素，1×MS铁盐，0.4mg/L维生素B1，，10mg/L肌醇，3％蔗糖)中，放在光照培养箱中进行培养，在不同的温度(10℃、15℃及22℃)下观察其开花率及开花时间，结果表明不同温度下花蕾形态处于生长中期及花前期时均能开花，且开花率高，结果下表所示。表1花蕾不同发育时期以及侵染后不同培养温度对花色沉默效果的影响结果表明在0.05Mpa的压力下，花蕾形态处于生长中期，在15℃、光照强度50-72μmol·m-2·s-1的条件下于光照培养箱中培养，于第4天花瓣颜色出现变化且趋于白色，沉默花朵多、沉默效果好。因此，根据上述结果，得出花蕾形态处于生长中期时，在0.05Mpa的压力下侵染至苞片呈水渍状，然后在15℃、光照强度为50-72μmol·m-2·s-1的条件下于光照培养箱中培养大约4d后，花蕾开放，花色改变，侵染效率达最高。以上所述仅是本专利技术的优选实施方式，应当指出，对于本
的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本专利技术的保护范围。本文档来自技高网...

【技术保护点】
石竹花色调控关键酶基因CHS沉默体系的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、从石竹幼苗叶片中提取mRNA，以反转录的cDNA为模板，根据香石竹CHS基因的保守序列设计引物，通过RT‑PCR采用Forward：GTCGCTTCATGCTCTACCAAC及Reverse：GCTAGGACTGAACGCATCCTC进行扩增，获得407bp的扩增产物；S2、将获得的407bp大小的片段连接到pGEM T‑easy上，测序得CHS片段；S3、将连接到载体pGEM T‑easy上的CHS片段在37℃用EcoR l酶切后连接到采用同样酶切后的TRV2载体上，得重组质粒pTRV2/DcCHS407；S4、将所得的重组质粒pTRV2/CHS407转化GV3101农杆菌，得含有重组质粒的农杆菌。

【技术特征摘要】
1.石竹花色调控关键酶基因CHS沉默体系的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、从石竹幼苗叶片中提取mRNA，以反转录的cDNA为模板，根据香石竹CHS基因的保守序列设计引物，通过RT-PCR采用Forward：GTCGCTTCATGCTCTACCAAC及Reverse：GCTAGGACTGAACGCATCCTC进行扩增，获得407bp的扩增产物；S2、将获得的407bp大小的片段连接到pGEMT-easy上，测序得CHS片段；S3、将连接到载体pGEMT-easy上的CHS片段在37℃用EcoRl酶切后连接到采用同样酶切后的TRV2载体上，得重组质粒pTRV2/DcCHS407；S4、将所得的重组质粒pTRV2/CHS407转化GV3101农杆菌，得含有重组质粒的农杆菌。2.如权利要求1所述的石竹花色调控关键酶基因CHS沉默体系的建立方法，其特征在于，所述步骤S4具体包括如下步骤：将含重组质粒pTRV2/CHS407的离心管...

【专利技术属性】
技术研发人员：贺学勤，刘佳，王志达，
申请(专利权)人：内蒙古农业大学，
类型：发明
国别省市：内蒙古;15