【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种玉米育种方法，尤其涉及一种转异戊烯基酰基转移酶基因玉米育种方法。
技术介绍
衰老是植物自身发育的降解或再活化的过程，在植物不断的生长与发育的过程中积累，衰老过程中，同化能力减弱或丧失，营养物质大量流失至新的组织器官中，当处在不利的环境条件下，如各种生物或非生物胁迫，可能会引起植物过早地衰老，缩短植物生命，而降低作物产量。衰老是一个受外部和内部各种因素影响的过程，也是一个植物内部精细调控的过程。影响叶片衰老的外部因素包括光照、温度、干旱、营养物质、非生物等原因，内部因素包括基因调控、内源或外源植物激素、年龄等。作物物种提供用于人类消费或为生产生物能源和其他用途的成熟或近成熟的果实或种子，植物发育的最后阶段涉及全株衰老过程，其中从营养植物部分的矿物元素，营养物质转移到成熟果实或贮藏器官。这种类型的衰老的是一个整体植物被称为一次果衰老与树木衰老和灌木不同，农作物是这种衰老类型。多年来关于作物植物产量和衰老之间的关系的假说有很多，Thomas认为，延长最大光合活性的一段时间，即延迟衰老，应得到更高的产量。叶面积和产量之间的正相关性应该适用于对大多数农作物对于总生物量生产和块茎作物，这种关系相对于要求种子产量的作物，两者之间关系更加复杂，特别是谷类作物。谷物产量是由库(即籽粒发育)和源(即光合作用营养组织)决定的。当前的主要看法是，库容大小是产量的主要限制因素，尤其是在小麦谷物如小麦。尤其是在结实期时，是...
【技术保护点】
一种转异戊烯基酰基转移酶基因玉米育种方法，其特征在于：包括ZmIPT2基因的克隆和植物表达载体构建、ZmIPT2基因对玉米的遗传转化和转ZmIPT2基因后代的功能检测；所述ZmIPT2基因的克隆和植物表达载体构建：试验材料为：章鱼碱型农杆菌菌株LBA4404，基础植物表达载体为pCAMBIA5300，启动子为Ubiquitin，终止子为T‑nos，CaMV35S启动子驱动Epsps基因作为选择标记；A：基础植物表达载体的线性化：用限制性内切酶SmaI酶切载体pCAMBIA5300‑Ubi‑EPSPS，冰板操作上，取200ulPCR管，加入2ul基础载体pCAMBIA5300‑Ubi‑EPSPS、2ul 10×buffer酶切缓冲液、限制性内切酶0.5ul、1ulBSA，轻轻混合均匀，37°C反应1h，65°C终止，胶回收试剂盒方法回收上述酶切线性载体；B：ZmIPT2基因片段克隆：根据In‑Fusion技术原理设计克隆引物，在ZmIPT2基因序列的上下游引物的外侧，分别引入经SmaI线性化的pCAMBIA5300‑Ubi‑EPSPS载体两端各15个碱基，使克隆引物外侧的15个碱基与线性...
【技术特征摘要】
1.一种转异戊烯基酰基转移酶基因玉米育种方法，其特征在于：包括ZmIPT2基因的克
隆和植物表达载体构建、ZmIPT2基因对玉米的遗传转化和转ZmIPT2基因后代的功能检测；
所述ZmIPT2基因的克隆和植物表达载体构建：试验材料为：章鱼碱型农杆菌菌株
LBA4404，基础植物表达载体为pCAMBIA5300，启动子为Ubiquitin，终止子为T-nos，CaMV35S
启动子驱动Epsps基因作为选择标记；
A：基础植物表达载体的线性化：用限制性内切酶SmaI酶切载体pCAMBIA5300-Ubi-
EPSPS，冰板操作上，取200ulPCR管，加入2ul基础载体pCAMBIA5300-Ubi-EPSPS、2ul10×
buffer酶切缓冲液、限制性内切酶0.5ul、1ulBSA，轻轻混合均匀，37°C反应1h，65°C终止，胶
回收试剂盒方法回收上述酶切线性载体；
B：ZmIPT2基因片段克隆：根据In-Fusion技术原理设计克隆引物，在ZmIPT2基因序列的
上下游引物的外侧，分别引入经SmaI线性化的pCAMBIA5300-Ubi-EPSPS载体两端各15个碱
基，使克隆引物外侧的15个碱基与线性化载体两端的15个碱基序列同源，用植物RNA提取试
剂盒，从玉米自交系K10叶片中提取总RNA进行RT-PCR反应逆转录得到cDNA序列，用带有
smaI酶切位点引物PCR扩增，
引物序列为：
I-G-4-R：5’-attcgagctcggtacccgggATGGAGCACGGTGCCGTCGC-3’
I-G-4-F：5’-GACTCTAGAGGATCCCCGGGTCATGCATCAGCCACGGCGGTGA-3’
20mlPCR体系：
无菌水13.5ul
10×trantaqBufferI(Mg2+)2ul2.5mM/L
I-Q-1-R0.5ul(10pM)
I-Q-1-F0.5ul(10pM)
dNTP2ul(200uM/L)
质粒1ul约1ug
高保真Tad酶0.5ul(2U)
反应程序：94℃预变性4min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，30cycle，
72℃延伸10min，8℃终止反应，1%琼脂糖凝胶电泳；
回收PCR产物片段，进行TA克隆、蓝白斑筛选，选取阳性克隆送上海生工测序；测序结果
和原序列进行比对；
ZmIPT2基因cDNA测序引物序列：
I-Q-1-R:ATGGAGCACGGTGCCGTCGC
I-Q-1-F:TCATGCATCAGCCACGGCGGTGA
C：植物表达载体构建与验证：根据上部试验克隆的目的基因片段，将目标基因片段与
酶切线性载体以摩尔比2:1混合到10μL去离子水中，再加入到含有In-Fusion酶的离心管
中混匀，PCR仪控制温度37℃15min，50℃15min，12℃放置10min，后转移到冰上，取2μL上
述连接产物50ul大肠杆菌5α感受态细胞，冰浴30min，42℃热激30s，之后37℃活化菌体1h，
均匀涂在含抗生素AMP+的LB固体培养基平板培养，挑取平板上单菌落，37℃LB液体培养
基培养12h，TransGen质粒提取试剂盒提取质粒，进行载体单酶切验证smaI单酶切验证，之
后电泳对比构建前后载体大小变化情况，最后送至由上海生工生物工程有限公司测序；与
Genebank库中的cDNA测序比对后导入农杆菌5α感受态-80°C保存；
D：农杆菌感受态制备与转化：挑取农杆菌菌落于2mlYEP液体（rif20mg/ml）培养基
中，150rpm/min温度28℃摇床过夜活化，取2ml过夜活化菌液接种于50mlYEP液体培养基中
150rpm/min，28℃培养生长至OD600≈0.5，吸取2ml菌液5000rpm离心5分钟，在2ml0.2mmol
预冷的CaCl2溶液涡旋感受态细胞；按200ul分装到1.5mlEp管中，储存于-80℃待用，将5ul
目的基因质粒(约1ug)加于200ul感受态细胞中，冰上放置30min；液氮中冷冻5min,后迅速
置37℃水浴中热激5min感受态细胞；在无菌工作台上加入1mlYEP培养基活化菌体，之后
150rpm/min，28℃摇床培养4h，将活化后的菌体4000rpm/min离心1min，去掉上清液，无菌工
作台中加入100ulYEP液体培养基涡旋细胞；涂上含Kan（50mg/ml）的YEP固体培养基平板
上，28℃恒温培养2-3天；
所述ZmIPT2基因对玉米的遗传转化：实验材料：玉米杂交种HiII，具体方法如下：
（1）工程菌液制备：活化的农杆菌平板，挑取单克隆，300ulYEP液体培养基稀释后，农杆
菌在含卡那霉素（Kan）50mg/L、利福平（rif）50mg/L的YEP培养基上19℃培养3天；
（2）农杆菌侵染玉米幼胚：农杆菌液5ml的液体侵染培养基中加入AS终浓度100uM；幼胚
放入侵染培养基，AS终浓度100uM；另从平板中挑取单菌落EHA105(携带质粒pCAMBIA-5300)
接种到5mLYEB液体培养基中，28°C，220r/min振荡培养至对数生长期成为农杆菌悬浮
液（OD550=0.6-0.7），加入幼胚在悬浊液中，静止5min；侵染后吸出菌液，将幼胚转移到共培
养基表面，幼胚盾片向上放置；封口膜密封培养皿，20℃暗培养三天；经过三天共培养，胚转
移到恢复培养基上，在28oC的暗培养7天；转移从共培养基到恢复培养基；幼胚28oC暗培养7
天，转移至筛选培养基I，含1.5mg/L草甘膦培养2周；两个星期以后，移至筛选培养基II，草
甘膦增加到3mg/L，侵染五周后，产生II型愈伤，将II型胚性抗性愈伤组织在再生培养基I
上暗培养三个星期完成成熟出苗，植株长至4-6厘米，根系充分发育，转移至土壤基质中，放
在培养室中26摄氏度/22摄氏度（白天/晚上）16小时光照，8小时黑暗，二周后，挑选生长状
态较好的幼苗，移栽入含有营养土：蛭石：大田土=1：1：1的大花盆中，定期浇水直至结实；
（3）PCR检测
Epsps基...
【专利技术属性】
技术研发人员：邸宏，周羽，曾兴，王振华，张林，祖洪月，邓艳雪，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23
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