一种RNA pulldown方法及试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种RNA pulldown方法及试剂盒。所述方法包含以下步骤：S1、磁珠预处理：使用BSA和寡核苷酸随机引物封闭含链霉亲和素的磁珠；S2、制备探针‑磁珠复合物；S3、提取并预处理细胞全蛋白：向提取细胞全蛋白样品中加入核糖核酸酶孵育，再加入磁珠孵育，收集上清；S4、pulldown；S5、RNP的收集。本发明专利技术具有如下有益效果：本发明专利技术通过预先使用BSA、寡核苷酸随机引物封闭磁珠，降低了磁珠与蛋白、RNA的非特异性结合。本发明专利技术通过系统性核酸酶防护，防止核酸酶的污染，增加了实验的稳定性和可靠性，重复性好，简化了实验流程。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种用于研究RNA与蛋白相互作用的RNA pulldown方法及试剂盒。
技术介绍
RNA结合蛋白(RBPs)在转录后水平调节基因的表达起着重要的作用，具体的作用包括mRNA前体的剪接、多腺苷化和稳定性的维持，mRNA从细胞核向细胞质的运输，mRNA的定位和翻译等。RBPs在这些过程中的调节作用是通过结合新合成的或者成熟后的转录物的特定序列实现的。于此同时，有很多RBPs能够识别RNA中的特定核苷酸序列。为了研究RNA与蛋白的相互作用建立了很多方法，这些方法包括EMSA、SELEX技术、RNA footprinting、RNA免疫沉淀(RIP)和RNA pulldown技术。RNA pulldown技术利用脱末端标记的RNA高效富集及鉴定RNA结合蛋白(RBPs)。此方法避免了抗体的使用，大大延伸了使用范围。随着RNA pulldown技术的不断完善，其在生命科学研究及医学领域中扮演的角色愈加重要。Hirofumi等通过RNA pulldown技术从线虫的极少量的感觉神经元中分离出mRNA，随后通过芯片分析鉴定出了感觉神经元的基因表达谱。(KUNITOMO H,UESUGI H,KOHARA Y,et al.2005.Identification of ciliated sensory neuron-expressed genes in Caenorhabditis elegans using targeted pull-down of poly(A)tails.Genome Biol[J],6:R17.)现如今的研究中，RNA pulldown研究的探针主要是合成生物素标记的单链探针，拓展了RNA的研究范围。Tsai等通过改进的RNA pulldown技术分析了长链非编码RNA(lincRNA)调节染色体状态和表观遗传。他们发现lincRNA HOTAIR作为至少两个组蛋白修饰复合体的脚手架。HOTAIR的5’端结合多梳抑制复合体2(PRC2)，3’端结合LSD1/CoREST/REST复合体，完成RNA介 导的RPC2和LSD1复合体的组装从而完成H3K27和H3K4两个位点的甲基化。(TSAI M C,MANOR O,WAN Y,et al.2010.Long noncoding RNA as modular scaffold of histone modification complexes.Science[J],329:689-693.)上述RNA pulldown方法具有较明显的缺点：(1)实验中使用到的珠子(琼脂糖珠子或磁珠)与蛋白的非特异结合，容易造成实验结果的假阳性；(2)RNA探针与蛋白结合的特异性不高；(3)实验过程还会受到核酸酶污染的影响。
技术实现思路
有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种RNA pulldown方法及试剂盒。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种RNA pulldown方法，包含以下步骤：S1、磁珠预处理：使用BSA(牛血清白蛋白)和寡核苷酸随机引物封闭链霉亲和素标记的磁珠；S2、制备探针-磁珠复合物：将步骤S1预处理的磁珠与生物素标记的RNA探针结合；S3、提取并预处理细胞全蛋白：向提取的细胞全蛋白中加入脱氧核糖核酸酶孵育，再加入未预处理的磁珠孵育，收集上清；S4、pulldown：将步骤S3收集的上清加入到步骤S2制备的探针-磁珠复合物中，加入含脱氧核糖核酸酶抑制剂和核糖核酸酶抑制剂孵育，收集磁珠，用含核糖核酸酶抑制剂的NT2buffer洗涤磁珠，得到蛋白-探针-磁珠复合物；S5、RNP(蛋白-探针复合物)的收集：将步骤S4制得的蛋白-探针-磁珠复合物加入Urea CHAPS buffer孵育，收集上清即得RNP。优选地，所述步骤S1磁珠预处理的方法为：用1mL 1×TES洗涤80μL链霉亲和素标记的磁珠，去除TES洗涤液，再向磁珠中加入1mL含BSA和寡核苷酸随机引物的1×TES，室温孵育30min后去除TES溶液。优选地，所述TES中BSA的浓度为0.05-0.5wt％，寡核苷酸随机引物的浓度为10-20μmol/L。优选地，所述步骤S1中寡核苷酸随机引物为20bp以内的DNA序列。优选地，所述步骤S2制备探针-磁珠复合物的方法为：将含2-5μg生物素标记RNA探针的溶液在90℃放置2min，立即置于冰上2min，加入50μL RNA structure buffer和20μL DEPC水，室温放置20min制备得到二级结构的RNA探针；将其加入预处理的磁珠中，并加入100μL 2×TES，25℃温和旋转混合30-60min，去上清；用1×TES洗涤磁珠两次，去除TES。优选地，所述步骤S3中预处理细胞全蛋白的方法为：向1.5×107个细胞提取获得的细胞全蛋白提取物中加入10μL DNase和3.2μL DNase Buffer，室温温和孵育1h；再加入40μL未预处理的磁珠，4℃温和旋转30min；收集上清液为预处理的细胞全蛋白。优选地，所述步骤S3提取细胞全蛋白的方法为：用PBS洗涤1.5×107个细胞一次；加入975μL RIP Buffer、10μL PMSF溶液、10μL protease inhibitor cocktail和5μL DTT溶液，匀浆器匀浆15-20次；4℃、1500g离心15min，收集上清即为细胞全蛋白提取物。优选地，所述步骤S4pulldown的具体方法为：将步骤S3制备的细胞全蛋白加入到探针-磁珠复合物中，并加入5μL RNase inhibitor、15μg poly(dI·dC)、5μL0.5M EDTA(乙二胺四乙酸)溶液和2.5μL 0.5M EGTA(乙二醇二乙醚二胺四乙酸)溶液；室温温和旋转孵育2h，收集磁珠；加入974μL NT2buffer、10μL PMSF溶液、10μL protease inhibitor cocktail、5μL DTT溶液和1μL RNase inhibitor，洗涤磁珠，再重复洗涤四次。本专利技术中选用EDTA作为脱氧核糖核酸酶的抑制剂。优选地，所述步骤S5中RNP的收集方法为：向蛋白-探针-磁珠复合物中加入40μL Urea CHAPS buffer，4℃孵育5-10h，收集上清即为探针-蛋白复合物。优选地，所述DTT溶液的浓度为100mM，所述PMSF溶液的浓度为10mg/mL。一种RNA pulldown试剂盒，包含下述试剂：磁珠及其处理试剂：2×TES溶液，链霉亲和素标记的磁珠，寡核苷酸随机引物；所述寡核苷酸随机引物的浓度为10-20μmol/L；RNA处理试剂：DNase，DNase Buffer，RNase inhibitor；蛋白提取及处理试剂：RIP buffer，Urea CHAPS buffer，protease inhibitor cocktail、DTT溶液、PMSF溶液；所述DTT溶液的浓度为100mM，所述PMSF 溶液的浓度为10mg/mL；探针及结合处理试剂：RNA structure buffer，NT2buffer，poly(dI·dC)。本专利技术针对目标区域设计特异性RNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种RNA pulldown方法，其特征在于，包含以下步骤：S1、磁珠预处理：使用BSA和寡核苷酸随机引物封闭链霉亲和素标记的磁珠；S2、制备探针‑磁珠复合物：将步骤S1预处理的磁珠与生物素标记的RNA探针结合；S3、提取并预处理细胞全蛋白：向提取的细胞全蛋白中加入脱氧核糖核酸酶孵育，再加入未预处理的磁珠孵育，去除磁珠，收集上清；S4、pulldown：将步骤S3收集的上清加入到步骤S2制备的探针‑磁珠复合物中，加入脱氧核糖核酸酶抑制剂和核糖核酸酶抑制剂孵育，收集磁珠，用含核糖核酸酶抑制剂的NT2 buffer洗涤磁珠，得到蛋白‑探针‑磁珠复合物；S5、RNP的收集：将步骤S4制得的蛋白‑探针‑磁珠复合物加入Urea CHAPS buffer孵育，去除磁珠，收集上清即得RNP。

【技术特征摘要】
1.一种RNA pulldown方法，其特征在于，包含以下步骤：S1、磁珠预处理：使用BSA和寡核苷酸随机引物封闭链霉亲和素标记的磁珠；S2、制备探针-磁珠复合物：将步骤S1预处理的磁珠与生物素标记的RNA探针结合；S3、提取并预处理细胞全蛋白：向提取的细胞全蛋白中加入脱氧核糖核酸酶孵育，再加入未预处理的磁珠孵育，去除磁珠，收集上清；S4、pulldown：将步骤S3收集的上清加入到步骤S2制备的探针-磁珠复合物中，加入脱氧核糖核酸酶抑制剂和核糖核酸酶抑制剂孵育，收集磁珠，用含核糖核酸酶抑制剂的NT2 buffer洗涤磁珠，得到蛋白-探针-磁珠复合物；S5、RNP的收集：将步骤S4制得的蛋白-探针-磁珠复合物加入Urea CHAPS buffer孵育，去除磁珠，收集上清即得RNP。2.根据权利要求1所述的RNA pulldown方法，其特征在于，所述步骤S1磁珠预处理的方法为：用1mL 1×TES洗涤80μL链霉亲和素标记的磁珠，去除TES洗涤液，再向磁珠中加入1mL含BSA和寡核苷酸随机引物的1×TES，室温孵育30min后去除TES溶液。3.根据权利要求2所述的RNA pulldown方法，其特征在于，所述TES中BSA的浓度为0.05-0.5wt％，寡核苷酸随机引物的浓度为10-20μmol/L。4.根据权利要求1或2所述的RNA pulldown方法，其特征在于，所述步骤S1中寡核苷酸随机引物为20bp以内的DNA序列。5.根据权利要求1所述的RNA pulldown方法，其特征在于，所述步骤S2制备探针-磁珠复合物的方法为：将含2-5μg生物素标记RNA探针的溶液在90℃放置2min，立即置于冰上2min，加入50μLRNA structure buffer和20μL DEPC水，室温放置20min制备得到二级结构的RNA探针；将其加入预处理的磁珠中，并加入100μL 2×TES，25℃温和旋转混合30-60min，去上清；用1×TES洗涤磁珠两次，去除TES。6.根据权利要求1所述的RNA pulldown方法，其特征在于，所述步骤S3中预处理细胞全蛋白的方法为：向1.5×107个细胞提取获得的细胞全蛋白提取物中加入10μL DNase和3.2μL DNase Buffe...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晓香，董先辉，张娟，曾健，周剑，
申请(专利权)人：广州伯信生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44