环境微生物快速检测方法技术

本发明专利技术公开了一种环境微生物的检测方法。１）微生物收集，微生物收集自空气滤网，２）微生物基因组提取，３）细菌16SrDNA扩增，真菌18SrDNA扩增，４）rDNA测序，５）数据分析，包括去污染序列、低质量序列，归并高相似度序列，序列注释；６）建立该环境细菌数据库，包含种类信息、序列信息和丰度信息；和该环境真菌数据库，包含种类信息、序列信息和丰度信息。本发明专利技术尤其适于对洁净区环境微生物进行普查，较常规基于培养的检测技术更加快捷、准确、灵敏，检测成本和时间大幅度降低，显著提高微生物污染监测和控制能力。另一方面，基因测序数据还提供了微生物分子水平的标记，对于追溯和判断微生物来源，准确识别污染源具有重要价值。

【技术实现步骤摘要】

[0001 ] 本专利技术涉及一种环境微生物的检测方法，可提高微生物的检测范围、节省检测费用、大幅度缩短检测时间。
技术介绍
微生物是自然界分布最广泛、数量最大的一类生物。它们个体微小、繁殖速度快、适应能力强。一些微生物经消化道入侵人体，比如说沙门氏菌、副溶血性弧菌、单增李斯特菌等，它们可造成胃肠道疾病，严重时会造成肝、脑、肾脏器损害，甚至死亡。而霉菌的危害在于它所产生的毒素，比如黄曲霉毒素、伏马菌素等，它们的毒性很强，具有很强的致癌性。另外，微生物及热原若通过粘膜或血管直接侵入人体，将对人体健康造成更严重、更直接的危害。因此，在食品及药品制造过程中，防范微生物污染至关重要。目前，食品和制药工业普遍采用洁净技术对生产环境中的悬浮微粒、微生物、有毒有害气体进行控制。为同时确保洁净区人员的正常活动，亦须使空气温度、湿度及压力在适宜范围内。洁净厂房及设施的建造不但要采用不易产尘、便于清洁的建筑材料和结构，而且需对空气进行调温、调湿和净化处理，以满足规定净化级别要求。在这种条件下，生产环境中最大的产尘源和微生物污染源通常是操作人员、设备和物料。因此必须使洁净区空气往复循环、动态更新。在洁净区，净化空气一般来自房间顶部的送风口，流经操作区后，携带着人员、设备、设施和物料脱落的微粒(包括微生物)流向低压区域，最后进入回风口，补充新空气后，再次进入空调及过滤系统获得再生。这种有组织的、无紊流的空气流动方式被称为“单向流”。在回风口设置的滤网，可以拦截室内“脏”空气中悬浮的微生物，真实完整地反映洁净区微生物生态特征。洁净技术不但用于生产活动，在食品药品的检验，医疗服务、科学研究领域都有广泛应用。洁净技术虽然能极大地降低食品药品受到微生物污染的风险，但并不是绝对的无菌环境，也不能杜绝外来微生物侵入被加工物料和产品。实际上，食品和口服药品均允许一定数量的非致病微生物残留。即便是无菌药品，在包装完成后，通常还要接受灭菌处理。只有非最终灭菌的无菌制品，才要求局部环境满足“绝对无菌”的要求。对洁净区或洁净室环境微生物进行监测不但是保证产品质量的要求，也是国家有关强制性法规的要求。洁净区实际上是一个特殊的生态环境，由于人员、设备、物料和大环境相对固定，微生物种群分布相对稳定，但也会随季节、房间消毒措施有规律地变化。了解微生物的种类及数量分布信息，掌握其变化规律，对于针对性地防范微生物污染具有重要意义。如生产环境中是否存在病原微生物；又如在处理淀粉和蛋白质含量较高的物料时，需关注是否存在某些霉菌；又如在生产热消毒产品时，需关注是否存在耐热微生物。此外，当发现产品受到特定微生物污染时，生产环境微生物监测数据将帮助技术人员找到潜在的污染源，进而采取有效的预防措施。另外在微生物检验时，环境而非样品中的微生物会造成检验结果的失真，如果有检验环境背景微生物信息(且具有分子水平的特征信息)，就能对检验结果进行甄别。然而，我国绝大多数的食品、药品生产企业的微生物检验能力还停留在细胞水平。这些检验方法是为适应产品放行检验而建立起来的，在开展微生物污染过程控制的检验方面普遍存在能力不足的情况。同时，传统的微生物学方法只能培养环境中不超过10%的微生物，不仅检测时间长，结果准确率差，而且效率低，工作量大。虽然业界已经开发了一些全自动微生物鉴定仪器，但是它们的鉴定范围受限于已知的微生物数据库。因此传统方法不能真实揭示微生物群落的多样性。总体上看，食品药品工业对于微生物污染处于相对被动的地位，不但缺乏对微生物侵染模式(如微生物种类、数量和途径)进行调查的手段，也缺乏量化的风险评价指标。实际生产中一味采用过度消毒(灭菌)措施，不但盲目低效，而且增加了环境污染和人员安全风险。对超标产品除了报废销毁，别无它途，也难以对后续生产起到指导作用。
技术实现思路
为监测洁净区微生物的种类和数量分布情况，提供背景环境的微生物信息，本专利技术提供了一种基于大规模基因测序技术的。环境微生物检测方法，所述的环境为一个单向空气流向的环境，步骤如下: 1)微生物收集，所述的微生物收集自空气滤网， 2)微生物基因组提取， 3)细菌16S rDNA扩增，真菌18S rDNA扩增，4) rDNA 测序， 5)数据分析,包括去污染序列、低质量序列，归并高相似度序列,序列注释； 6)建立该环境细菌数据库，包含种类信息、序列信息和丰度信息；和该环境真菌数据库，包含种类信息、序列信息和丰度信息。优选地，所述的环境为需控制空气微粒和微生物污染的洁净区。优选地，步骤I )微生物收集的方法如下:定期收取单向流空气回风口的滤网，对在空气滤网上的微生物进行洗脱后，洗脱液先经过纱布进行初级过滤，去除大颗粒干扰物，过滤液再通过0.22 μ m滤膜，最终收集滤膜及其拦截的微生物作为待检测样本。优选地，步骤2 )微生物基因组提取的方法如下:样本按照下列方法提取微生物基因组，将收集的微生物离心沉淀后，重悬于无菌PBS中，加入50μ L溶菌酶(10 mg/mL),6μ L 变溶菌素(25000 U/mL), 3 μ L 溶葡球菌酶(4000 U/mL),和 41 μ L ΤΕ50 溶液(10 mMTris.HCL和50 mM EDTA, pH 8.0),37° C消化一小时；然后加入0.1-mm-直径的石英砂，在振荡仪上2100转，振荡5分钟，振荡后提取DNA。优选地，步骤3 )中，对于细菌扩增Vl到V3区域，正向引物序列AGAGTTTGATCCTGGCTCAG (SEQ ID NO I)，反向引物序列:TTACCGCGGCTGCTGGCAC (SEQ ID NO2)， 对于真菌扩V4区域，正向引物序列GGCAAGTCTGGTGCCAG (SEQ ID NO 3 )，反向引物序列:ACGGTATCTRATCRTCTTCG (SEQ ID NO 4 )。优选地，步骤4 )中，rDNA测序，测序仪优先采用Roche454、Illumina的Miseq,Hiseq 二代测序仪。优选地，步骤5)中，对于拼接完的序列分别提交到greengenes.lbl.gov上的NAST和Bellerophon 3比对程序，和www.ncb1.nlm.nih.gov上的Nt/Nr库比对，过滤掉比对污染序列，剩余的序列利用BLAST软件和Greengenes数据库中已知的16S/18S序列数据库进行比对，一致性在95%以上的序列注释为相应的系统群，不满足的则为新的系统群；BLAST序列比对的具体判断标准为(a)与某种系的代表参照序列相比，未知菌株序列的相似性> 99%，未知菌株鉴定为该种；(b)与某种系的代表参照序列相比，未知菌株序列的相似性> 97%，但〈99%，未知菌株鉴定为该属；(c)如未知菌株序列相似性< 97%，未知菌株不能鉴定为该种或属；(d)如存在两个或两个种系以上参照菌株与未知菌株序列相似性^ 99%，且两者相似性相差< 0.5%，则暂将未知菌株归为其中相似性较高种系，但不排除未知菌株为另一种的可能性。优选地，相对于所述步骤I )搜集的微生物的对照样本的收集方法，利用细菌、真菌培养基，收集了该环境各个角落的微生物，包括沉降菌和悬浮菌，将所有的培养基的微生物混合后作为对照本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种环境微生物检测方法，其特征在于，所述的环境为一个单向空气流向的环境，步骤如下：１）微生物收集，所述的微生物收集自空气滤网，２）微生物基因组提取，３）细菌16S?rDNA扩增，真菌18S?rDNA扩增，４）rDNA测序，５）数据分析，包括去污染序列、低质量序列，归并高相似度序列，序列注释；６）建立该环境细菌数据库，包含种类信息、序列信息和丰度信息；和该环境真菌数据库，包含种类信息、序列信息和丰度信息。

【技术特征摘要】
1.一种环境微生物检测方法，其特征在于，所述的环境为一个单向空气流向的环境，步骤如下: .1 )微生物收集，所述的微生物收集自空气滤网， . 2)微生物基因组提取， 3)细菌16S rDNA扩增，真菌18S rDNA扩增， . 4) rDNA 测序， .5)数据分析,包括去污染序列、低质量序列，归并高相似度序列,序列注释； .6)建立该环境细菌数据库，包含种类信息、序列信息和丰度信息；和该环境真菌数据库，包含种类信息、序列信息和丰度信息。2.根据权利要求1所述的方法，所述的环境为需控制空气微粒和微生物污染的洁净区。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤I)微生物收集的方法如下:定期收取单向流空气回风口的滤网，对在空气滤网上的微生物进行洗脱后，洗脱液先经过纱布进行初级过滤，去除大颗粒干扰物，过滤液再通过0.22 μ m滤膜，最终收集滤膜及其拦截的微生物作为待检测样本。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)微生物基因组提取的方法如下:样本按照下列方法提取微生物基因组，将收集的微生物离心沉淀后，重悬于无菌PBS中，加入50μ L溶菌酶(10 mg/mL), 6 μ L变溶菌素(25000 U/mL)，3 μ L溶葡球菌酶(4000 U/mL)，和 41 μ L ΤΕ50 溶液(10 mM Tris.HCL 和 50 mM EDTA, pH 8.0) ,37° C 消化一小时；然后加入0.1-mm-直径的石英砂，在振荡仪上2100转，振荡5分钟，振荡后提取DNA。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，对于细菌扩增Vl到V3区域，正向引物序列AGAGTTTGATCCTGGCTCAG (SEQ ID NO I)，反向引物序列:TTACCGCGGCTGCTGGCAC (SEQ ID NO 2)， 对于真菌扩增V4区域，正向引物序列GGCAAGTCTGGTGCC...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈欢，刘雳，郭红樱，张遐耘，张启坤，方序，钱兵，
申请(专利权)人：浙江天科高新技术发展有限公司，
类型：发明
国别省市：