本发明专利技术公开了一种基于LAMP技术的旋毛虫快速检测方法及引物组合物。一种用于检测旋毛虫的特异性的LAMP引物组合物，由F3、B3、FIP和BIP四条引物组成，F3、B3、FIP和BIP引物序列分别如SEQ ID NO.1‐SEQ ID NO.4所示。本发明专利技术所述的引物组合物在制备旋毛虫检测试剂中的应用。该引物组合物和对应的检测方法具有特异性强、敏感性高的优点。对旋毛虫、大肠杆菌、猪囊虫、弓形虫等不同病原进行检测，结果能且只能从旋毛虫样品中获得阳性扩增。该检测方法敏感性是普通PCR检测技术的1000倍，1克肉品中含1条肌肉幼虫时也能检测出来。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于兽医生物技术和分子生物学
，涉及一种基于LAMP技术的旋 毛虫快速检测方法及引物组合物。
技术介绍
旋毛虫病是世界性分布的人兽共患寄生虫病，该病流行于哺乳动物间，人和动物 因生吃或半熟食含旋毛虫包囊的肉品而感染。该病危害十分严重，不但给畜牧业生产造成 巨大经济损失，而且对人类健康带来严重威胁。我国是世界上该病危害最为严重的少数几 个国家之一，现已将其列为3大人兽共患寄生虫病（旋毛虫病，囊虫病及棘球蝴病）之首， 而且作为肉类进出口、屠宰动物以及我国政府提出让人民吃上"放心肉"首检和必检的人兽 共患病。 我国已发现多种动物能感染旋毛虫病，分别为猪、犬、牛、猫、羊、鼠、狐狸、黄鼠狼、 貂、貉、熊及麂，除海南和台湾尚无相关资料报道外，其它省区均已成为动物旋毛虫病流行 区。我国猪的感染十分普遍，一些高发省份和地区，感染率高达10 %~30 %。资料显示，我 国自1964年至2004年已暴发流行旋毛虫病600余起，报道病例达26000余人，死亡250余 人，其中95%的病例由猪肉引发。近年来，随着饲养动物及居民肉类消费量的增加，以及感 染动物种类的增多，东北及中原地区又相继出现了大量由于食用狗肉、羊肉和马肉而暴发 人旋毛虫病，人的发病率不断呈上升。卫生部2001-2004年在全国组织开展的"第二次全国 人体重要寄生虫病现状调查"结果显示旋毛虫病血清阳性率平均高达3. 38%，推测目前我 国人旋毛虫病隐性感染高达4千余万人。 进行动物肉品旋毛虫病的检验检疫对预防该病的感染和传播具有重大意义。目 前，我国动物旋毛虫病的检疫中主要使用镜检法和消化法，具有操作简便等优点，但需要检 疫者具有很好的专业知识和经验，工作人员的劳动强度大，此外，肉品感染强度较低时容易 出现漏检。PCR诊断技术大大提高了检验检疫方法的敏感性，然而因PCR仪价格较高、扩 增产物需要进行电泳分析等不利因素，该方法的应用受到很大的限制。环介导等温扩增 (Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)技术于 2000 年由Notomi等人建立， 该方法是一种快速、简单、灵敏、特异、低成本的核酸扩增方法，在等温条件下和较短的时间 内可将目标基因进行大量扩增，已应用到病毒、细菌等病原的检测中。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种基于LAMP技术的旋毛虫快 速检测方法及引物组合物。 提供一种能快速准确检测动物肉品和肉制品中旋毛虫的方法。 本专利技术可通过如下技术方案实现： 一种用于检测旋毛虫的特异性的LAMP引物组合物，由F3、B3、FIP和BIP四条引物 组成，F3、B3、FIP和BIP引物序列分别如SEQIDNO. 1-SEQIDN0. 4所示。 本专利技术所述的引物组合物在制备旋毛虫检测试剂中的应用。 一种用于检测旋毛虫的LAMP检测试剂盒，包含所述的特异性的LAMP引物组合物。 所述的用于检测旋毛虫的LAMP检测试剂盒，优选包含：10μmol/L的FIP， 10ymol/L的BIP，10ymol/L的F3、10ymol/L的B3,10mmol/L的dNTPs，5mol/L甜菜碱， 0·lmol/L的MgS04,8μ/μ1 的BstDNA聚合酶，lOXBstDNAΒμffer以及ddH20。 所述的用于检测旋毛虫的LAMP检测试剂盒，还包括SYBRGreenI染料。 -种检测旋毛虫的方法，提取待检样品中全基因，以提取的DNA为模板，利用本发 明所述的特异性的LAMP引物组合物进行LAMP扩增反应；取LAMP扩增反应产物进行1 %的 琼脂糖凝胶电泳，如果扩增产物中存在其特有的阶梯状扩增条带则表示结果为阳性，样品 中含有旋毛虫，如果没有扩增条带产生则表示结果为阴性；或者向LAMP扩增反应产物中加 入SYBRGreenI染料，在日常光和/或紫外光下检测，如果反应产物在日常光下显绿色、在 紫外光下产生强烈荧光，则表示结果为阳性，样品中含有旋毛虫，如果反应产物在日常光下 显橙色、紫外光下无荧光产生则表示结果为阴性。 所述的检测旋毛虫的方法，优选包括以下步骤： (1)提取待检样品DNA; ⑵按照以下顺序分别加入： 将上述反应体系充分混匀，95°C水浴锅中孵育5min后，立即转移至冰水中孵育 lmin，再加入BstDNA聚合酶（8U/μ1) 1μ1，充分混匀； (3)将该反应体系置于63°C的恒温水浴锅中孵育45-60min; (4)将反应体系转移到80C的丨旦温水洛锅中保温10min; (5)取5μ1反应产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳；根据是否能够扩增出阶梯状扩 增条带来判断结果；或者向剩余的20μ1反应产物中加入0. 5μ1SYBRGreenI，观察颜色 变化判断结果。 本专利技术所述的引物组合物在检测肉制品中旋毛虫的应用。 本专利技术基于LAMP检测技术的诸多优点，以旋毛虫ITSII基因为分子靶标，设计其 独特的引物，建立了旋毛虫LAMP检测方法，对该方法的敏感性和特异性进行了分析，并将 该检测方法应用于市售肉品的检测。本专利技术具有以下优点和效果： 1.该引物组合物和对应的检测方法具有特异性强、敏感性高的优点。对旋毛虫、 大肠杆菌、猪囊虫、弓形虫等不同病原进行检测，结果能且只能从旋毛虫样品中获得阳性扩 增。该检测方法敏感性是普通PCR检测技术的1000倍，1克肉品中含1条肌肉幼虫时也能 检测出来。 2.该检测技术操作简便、所需时间短、不需要特殊仪器，所需试剂价格便宜，几乎 所有实验室都能进行操作。提取肌肉样品中DNA后，取适量DNA至反应缓冲液中，至恒温水 浴锅或培养箱中孵育30-60分钟即可直接观察结果。该检测方法具有方便、快速、价廉等优 势。【附图说明】 图1旋毛虫ITS-II基因的扩增 A.常规PCR扩增产物电泳图：Μ为DNA标准分子Marker，1为阴性对照（橙色），2 为旋毛虫（绿色）B.LAMP扩增产物电泳图：Μ为DNA标准分子Marker，1为阴性对照（橙色），2为旋 毛虫（绿色）C.LAMP扩增产物显色图：1为阴性对照（橙色），2为旋毛虫（绿色）图2LAMP检测技术敏感性（模板进行梯度稀释） A.常规PCR扩增产物电泳图：Μ为DNA标准分子Marker，1-9分别为旋毛虫DNA进 行 106、107、108、109、101Q、1011、1012、1013、10 14 倍稀释B. LAMP扩增产物电泳图：Μ为DNA标准分子Marker，1-9分别为旋毛虫DNA进行 ?ο6、?ο7、?ο8、?ο9、?ο10、1011、1012、1013、10 14 倍稀释C.LAMP扩增产物显色图：1-9分别为旋毛虫DNA进行ΚΛ?Ο'ΚΛ?Ο'ΙΟ'ΙΟ11、 1012、1013、10 14倍稀释，其中1~7泳道显绿色，8、9泳道显橙色。 图3LAMP检测技术敏感性（不同旋毛虫添加量）A. LAMP扩增产物电泳图：Μ为DNA标准分子Marker，1-5分别为在1克肌肉中添加 0、1、3、5、10条肌肉旋毛虫幼虫B.LAMP扩增产物显色图：1-5分别为在1克肌肉中添加0、1、3、5和10条肌肉旋毛 虫幼虫，1泳道显橙色，2~5泳道显绿色。 图4LAMP检测技术特异性A.LAMP本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测旋毛虫的特异性的LAMP引物组合物，其特征在于由F3、B3、FIP和BIP四条引物组成，F3、B3、FIP和BIP引物序列分别如SEQ ID NO.1‐SEQ ID NO.4所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：严若峰，李祥瑞，徐立新，宋小凯，黄芸，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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