用于PCR扩增的微量丝状真菌高纯度DNA简易制备方法技术

本发明专利技术公开了一种用于PCR扩增的微量丝状真菌高纯度DNA简易制备方法，包括以下几个步骤：步骤一，在微型离心管中，加入0.3～0.5 mm无菌石英砂至管总体积的1/20，挑取1～3 mm2真菌菌体菌丝样本于离心管中，加入几丁质酶溶液，捣碎，37℃孵育30分钟；步骤二，加入细胞裂解液，95℃振荡10分钟，离心收集含有核酸的上清液；步骤三，加入磁珠，对核酸

【技术实现步骤摘要】
用于PCR扩增的微量丝状真菌高纯度DNA简易制备方法


[0001]本专利技术涉及核酸提取工艺的领域，尤其涉及一种用于PCR扩增的微量丝状真菌高纯度DNA简易制备方法的


技术介绍

[0002]在真菌分子生物学鉴定中，DNA模板在PCR扩增反应中起着至关重要的作用，高纯度的DNA可以减弱或消除导致PCR假阴性的PCR抑制因子。真菌的DNA提取过程中，一定程度有效地破坏真菌细胞壁是获取核酸的关键，而丝状真菌相比酵母菌，其细胞壁成分更为复杂，主要由几丁质、葡聚糖、甘露聚糖和糖蛋白等组成，更难被破坏。现有的真菌高纯度的核酸提取常采用试剂盒提取法，市场上常见的包括QIAGEN 12888 土壤DNA提取试剂盒、Biospin 真菌基因组DNA提取试剂盒、天根植物提取试剂盒等。针对菌落小或微量的丝状真菌样本，采用试剂盒提取法很难获得PCR扩增反应所需的核酸量，而且操作中还需使用球磨仪、高速离心机等仪器，提取成本也相对较高。

技术实现思路

[0003]为了克服现有技术的不足, 本专利技术的目的是提供一种用于PCR扩增的微量丝状真菌高纯度DNA简易制备方法，不采用试剂盒提取法，实现微量丝状真菌DNA的快速高质量低成本制备。
[0004]一种用于PCR扩增的微量丝状真菌高纯度DNA简易制备方法，包括以下步骤：步骤一，在200 μL离心管中，加入尺寸为0.3～0.5 mm的石英砂至管总体积的1/20，用无菌牙签挑取1 mm2真菌菌体菌丝样本于离心管中，加入25 μL几丁质酶溶液，盖上管盖，振荡混匀，500 rpm 瞬时离心后，37℃孵育30分钟；步骤二，加入25 μL细胞裂解液，95℃振荡10分钟，离心收集含有核酸的上清液；步骤三，加入Beckman的XP纳米磁珠，形成核酸
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磁珠复合物，在磁力架上移除上清液，加入洗涤液对核酸
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磁珠复合物进行洗涤；移除磁力架，加入洗脱液对核酸
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磁珠复合物进行洗脱，获得高纯度的DNA。
[0005]所述石英砂尺寸为0.3～0.5 mm，经121℃高温及灭菌处理30分钟。
[0006]所述几丁质酶来源于链球菌属真菌，其溶液浓度为1 mg/mL；所述细胞裂解液，含Triton X
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100 5.0%～10.0%，Tween 20 1.0%～5.0%，40 mM～100 mM Tris
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HCl，pH 6.0。
[0007]所述洗涤液为75%～85%乙醇。
[0008]所述洗脱液为TE缓冲液，含10 mM Tris
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HCl，1 mM EDTA， pH=8.0。
[0009]本专利技术的有益效果：本专利技术采用细胞壁酶解、蛋白等变性、磁珠纯化等步骤，专一性地解决丝状真菌破壁困难，去除丝状真菌样本中的杂质及PCR抑制因子等技术问题。该制备方法具有操作简单，试剂简单易得，样本量要求低，制备成本低的优点。
附图说明
[0010]图1是微量丝状真菌提取过程中不同阶段核酸作为模板的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；其中，1、100 bp Marker；2、 EG1
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1裂解后的上清液；3、 EG1
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2裂解后的上清液；4、 EG2
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1裂解后的上清液；5、 EG2
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2裂解后的上清液；6、 CGN1
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1裂解后的上清液；7、 CGN1
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2裂解后的上清液；8、 CGN2
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1裂解后的上清液；9、 CGN2
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2裂解后的上清液。
[0011]图2是本专利技术添加几丁质酶溶液与QIAGEN 12888 土壤DNA提取试剂盒获得的核酸作为模板的PCR产物琼脂糖凝胶电泳对比图；图中，1、100 bp Marker；2、 EG1
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1；3、 EG1
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2；4、 EG2
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1；5、 EG2
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2；6、 CGN1
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1；7、 CGN1
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2；8、 CGN2
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1；9、 CGN2
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2；10、 CG1
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1；11、 CG1
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2；12、 CG2
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1；13、 CG2
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2。
具体实施方式
[0012]以下结合附图和实施例对本专利技术作进一步阐述。
[0013]实施例1一种用于PCR扩增的微量丝状真菌高纯度DNA简易制备方法，包括以下几个步骤：步骤一，在200 μL离心管中，加入石英砂至管总体积的1/20，用无菌牙签挑取黑曲霉、橘青霉各1 mm2菌体菌丝于离心管中作为实验组，并标记为EG1、EG2，各加入25 μL几丁质酶溶液，盖上管盖，振荡混匀，500 rpm 瞬时离心后，37℃孵育30分钟；鉴于30分钟的孵育时间已达到丝状真菌破壁的目的，如因实验安排，采用37℃孵育更长时间或过夜处理，均可实施，但时间过长，核酸的不可控性会增大，可能会对后期实验造成不利影响，建议酶解时间30分钟。
[0014]步骤二，在上述溶液中加入25 μL细胞裂解液，95℃振荡10分钟，10000 g 离心5分钟，将上清液转移至新的200 μL离心管中；分别吸取2.0 μL含核酸的上清液进行PCR扩增反应，PCR反应体系为25 μL：2
×
Phanta Max Master Mix 12.5 μL，ITS1 (5
’‑
TCCGTAGGTGAACCTGCGG
‑3’
) (5 μM) 0.5 μL，ITS4 (5
’‑
TCCTCCGCTTATTGATATGC
‑3’
) (5 μM) 0.5 μL，DNA模板 2.0 μL，Nuclease
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free H2O 9.5 μL；PCR反应参数：95℃，预变性2 min；95℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s，30个循环；72℃ 5 min；8℃，保存。反应结束后取3 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测结果如图1所示。
[0015]步骤三，在上述剩余的上清液中加入50 μL纳米磁珠，轻弹混匀，500 rpm瞬时离心后，室温孵育5分钟，将离心管置于磁力架上，磁吸5分钟，形成核酸
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磁珠复合物，移除清液；加入200 μL洗涤液对核酸
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磁珠复合物进行洗涤，弃清液；室温条件下离心管开盖干燥5分钟，待磁珠干燥至磨砂状，加入30 μL洗脱液，移除磁力架，混匀后室温孵育5分钟，将离心管置于磁力架上磁吸5分钟，转移清液至新的200 μL微型离心管中即为获得的DNA。DNA在
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20℃保存。
[0016]其中，石英砂尺寸为0.3～0.5 mm，且该石英砂经121℃高温及灭菌处理30分钟；几丁质酶来源于链球菌属真菌，其溶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于PCR扩增的微量丝状真菌高纯度DNA简易制备方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一，在200 μL离心管中，加入尺寸为0.3～0.5 mm的石英砂至管总体积的1/20，用无菌牙签挑取1 mm2真菌菌体菌丝样本于离心管中，加入25 μL几丁质酶溶液，盖上管盖，振荡混匀，500 rpm 瞬时离心后，37℃孵育30分钟；步骤二，加入25 μL细胞裂解液，95℃振荡10分钟，离心收集含有核酸的上清液；步骤三，加入Beckman的XP纳米磁珠，形成核酸
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磁珠复合物，在磁力架上移除上清液，加入洗涤液对核酸
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磁珠复合物进行洗涤；移除磁力架，加入洗脱液对核酸
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磁珠复合物进行洗脱，获得高纯度的DNA。2.如权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘洋，王庭璋，钟啸萍，王焕英，毛鹏阳，
申请(专利权)人：浙江天科高新技术发展有限公司，
类型：发明
国别省市：