本发明专利技术提供的一种提取棉花黄萎病致病菌孢内毒素的方法及其应用，通过采用特定工艺参数及提取方法，能够有效的提取棉花黄萎病致病菌孢内毒素，克服了现有技术中所披露的提取胞外毒素作为侵染源却未见植株发病的技术缺陷。通过本发明专利技术提供的提取方法提取获得的棉花黄萎病致病菌孢内毒素，采用叶圆盘法，验证对棉花的致病性，叶圆盘不仅有黄化而且枯斑显著加重现象，表通过本发明专利技术提供的提取方法获得的胞内毒素具有较高的侵染力，对于棉花抗病育种技术领域具有广泛的实用性与巨大的潜在开发价值。值。值。
【技术实现步骤摘要】
一种提取棉花黄萎病致病菌孢内毒素的方法及其应用
[0001]本专利技术属于植物病害防治领域，具体涉及棉花黄萎病致病菌孢内毒素提取及其应用的
技术介绍
[0002]棉花黄萎病是严重制约棉花的重要因素，致病菌大丽轮枝菌是轮枝菌属的真菌，初侵染源以微菌核为主，该结构呈黑色致密的凝结状，可以在地下生存数十年之久，化学农药对该病的防治防效甚微，因此，抗棉花黄萎病品种的选育成为治疗该病的一个重要措施，因黄萎病变异速度快，菌株种类多而复杂，造成黄萎病致病机理尚不明确，因此，目前存在多种的方式对棉花黄萎病抗性进行鉴定，室外主要是建立病圃，利用自然环境进行鉴定，因为自然气候的地理环境以及气候条件的变化，造成棉花品种发病情况，状态不一，往往需要几年才能完成，费事费力。室内主要有分生孢子蘸根法以及毒素鉴定法两种，分生孢子蘸根法是室内抗黄萎病品种鉴定的主要方式，但其对棉花种植要求高，需要全程浇灌纯净水，并且伤根部位和程度难以控制，造成抗性呈“假阳性”的几率高，毒素鉴定法是近年来发展起来的一种鉴定的新方式，研究者普遍认为致病毒素是胞外分泌型，并且已从T9，VD8，SS
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43等菌系液体培养基质中分离出相关毒素，需要培养基质多且量大，才能满足实验所需求的毒素，经费多且费事，是目前造成该研究迟缓的主要原因之一，但是对于其他菌系的致病毒素则无相关的研究，因此对其他菌系的胞内毒素研究这方面尚存在空白。大丽轮枝菌株为V991，该菌株是强致病性、落叶型的菌株，该菌株利用分生孢子浸根法可以快速让农作物发病，提取孢外毒素作为侵染源却未见植株发病，对于其侵染的具体来源并不明确。
技术实现思路
[0003]针对现有技术中尚无关于棉花黄萎病致病菌大丽轮枝菌株为V991具体侵染来源的研究，以及其相配套效果显著的孢内毒素的提取方法的技术现状，本专利技术创造性的提供一种提取棉花黄萎病致病菌孢内毒素的方法，通过采用特定工艺参数及提取方法，能够有效的提取棉花黄萎病致病菌孢内毒素，克服了现有技术中所披露的提取孢外毒素作为侵染源却未见植株发病的技术缺陷。通过本专利技术提供的提取方法提取获得的棉花黄萎病致病菌孢内毒素，采用叶圆盘法，验证对棉花的致病性，叶圆盘不仅有黄化而且枯斑显著加重现象，表通过本专利技术提供的提取方法获得的孢内毒素具有较高的侵染力，对于棉花抗病育种
具有广泛的实用性与巨大的潜在开发价值。
[0004]本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：
[0005]本专利技术提供一种提取棉花黄萎病致病菌孢内毒素的方法，所述的提取方法，采用如下步骤提取获得：
[0006](1)将直径为0.5cm的棉花黄萎病菌饼接种到经120℃灭菌15min的Czapek
’
s培养液中，在25℃转速为130rpm/min的摇床中振荡培养3
‑
6天，至分生孢子在三角瓶壁上有成团结构出现为止；
[0007](2)将步骤(1)中培养获得的液体经140目和400目钢筛双层过滤后即可获得孢子悬浮液；
[0008](3)将步骤(2)中制备获得的孢子悬浮液在常温条件下，14000rpm/min离心10min，收集沉淀；
[0009](4)将步骤(3)中收集获得的沉淀采用灭菌水洗涤沉淀，重复14000rpm/min离心10min离心步骤，收集沉淀；
[0010](5)在步骤(4)中收集获得的沉淀中加入pH值为6.5
‑
8.5的0.05M磷酸缓冲液中悬浮沉淀；
[0011](6)采用灭菌水将步骤(5)中制备获得的悬浮液孢子浓度调节至107个/mL；
[0012](7)将步骤(6)中制备获得的孢子悬浮液经120Mpa，温度10
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100℃，高压均浆机反复研磨3
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4次；
[0013](8)将步骤(7)中制备获得的均质液体于4℃，18000rpm/min离心25min，弃上清，用0.45μm的微孔滤膜过滤除杂菌，最终得到滤液为孢内毒素。
[0014]优选的，所述的0.05M磷酸缓冲液的pH值为6.5。
[0015]优选的，所述的高压均浆机研磨时温度为10℃。
[0016]优选的，所述的棉花黄萎病菌饼的振荡培养时间为5天。
[0017]进一步的，本专利技术还提供所述的提取棉花黄萎病致病菌孢内毒素的方法在构建棉花黄萎病侵染模型中的应用。
[0018]进一步的，本专利技术还提供所述的提取棉花黄萎病致病菌孢内毒素的方法在培育棉花黄萎病抗性品种中的应用。
[0019]更进一步的，本专利技术还提供所述的提取棉花黄萎病致病菌孢内毒素的方法提取获得的棉花黄萎病致病菌孢内毒素在构建棉花黄萎病侵染模型中的应用。
[0020]更进一步的，本专利技术还提供所述的提取棉花黄萎病致病菌孢内毒素的方法提取获得的棉花黄萎病致病菌孢内毒素在培育棉花黄萎病抗性品种中的应用。
[0021]本专利技术具有以下有益的技术效果：
[0022](1)本专利技术创造性的提供一种提取棉花黄萎病致病菌孢内毒素的方法，通过采用特定工艺参数及提取方法，能够有效的提取棉花黄萎病致病菌孢内毒素，克服了现有技术中所披露的提取孢外毒素作为侵染源却未见植株发病的技术缺陷。
[0023](2)通过本专利技术提供的提取方法提取获得的棉花黄萎病致病菌孢内毒素，采用叶圆盘法，验证对棉花的致病性，叶圆盘不仅有黄化而且枯斑显著加重现象，表通过本专利技术提供的提取方法获得的孢内毒素具有较高的侵染力，对于棉花抗病育种
具有广泛的实用性与巨大的潜在开发价值。
附图说明
[0024]图1所示为大丽轮枝菌显微观察及测序鉴定图。其中图A所示为大丽轮枝菌菌丝显微形态；图B所示为大丽轮枝菌分生孢子梗显微形态；图C所示为ITS1/ITS4PCR扩增序列，Bar＝20μm。
[0025]图2所示为不同pH条件下大丽轮枝菌V991分生孢子破碎情况图。其中图所示为不同pH条件下大丽轮枝菌破碎程度的显微形态；图B所示为不同pH条件下大丽轮枝菌三次研
磨后的破碎率情况，Bar＝20μm。
[0026]图3所示为采用Bradford法对孢内毒素进行测定结果图。
[0027]图4所示为不同pH提取毒素对棉花致病力鉴定结果图。
[0028]图5所示为不同提取温度获得的毒素对棉花致病力鉴定结果图。
[0029]图6所示为不同摇菌天数获得的毒素对棉花致病力鉴定结果图。
具体实施方式
[0030]菌株材料：
[0031]本专利技术中所采用的棉花黃萎病原菌：大丽轮枝菌V991(Verticillium daliaeKleb)，为常见菌株，公众可从中国农业科学院植物保护研究所获得。
[0032]棉花品种：供试棉花品种(系)湘棉13号，2890，中棉12号，辽棉15号，渝棉1号，由新疆农业科学院经济作物研究所提供，分生孢子浸根法及毒素叶盘侵染法所用的棉花品种为辽棉15号。
[0033]本申请中采用的马铃薯葡萄糖琼脂(Pot本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种提取棉花黄萎病致病菌孢内毒素的方法，其特征在于，采用如下步骤提取获得：(1)将直径为0.5cm的棉花黄萎病菌饼接种到经120℃灭菌15min的Czapek
’
s培养液中，在25℃转速为130rpm/min的摇床中振荡培养3
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6天，至分生孢子在三角瓶壁上有成团结构出现为止；(2)将步骤(1)中培养获得的液体经140目和400目钢筛双层过滤后即可获得孢子悬浮液；(3)将步骤(2)中制备获得的孢子悬浮液在常温条件下，14000rpm/min离心10min，收集沉淀；(4)将步骤(3)中收集获得的沉淀采用灭菌水洗涤沉淀，重复14000rpm/min离心10min离心步骤，收集沉淀；(5)在步骤(4)中收集获得的沉淀中加入pH值为6.5
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8.5的0.05M磷酸缓冲液中悬浮沉淀；(6)采用灭菌水将步骤(5)中制备获得的悬浮液孢子浓度调节至107个/mL；(7)将步骤(6)中制备获得的孢子悬浮液经120Mpa，温度10
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100℃，高压均浆机反复研磨3
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4次；(8)将步骤(7)中制备获得的均质液体于...
【专利技术属性】
技术研发人员：赖成霞，玛依拉，
申请(专利权)人：新疆农业科学院经济作物研究所，
类型：发明
国别省市：
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