一种基因工程重组表达多肽的系统纯化方法技术方案

本发明专利技术公开了一种基因工程重组表达多肽的系统纯化方法，该纯化方法包括以下步骤：重组表达菌体的裂解、镍离子柱纯化方法、重组表达菌体的裂解的自裂解过程、疏水层析纯化步骤、反相色谱纯化步骤和切向流超滤浓缩。通过该基因工程重组表达多肽的系统纯化方法，可获得重组多肽的纯度高达97％以上。获得重组多肽的纯度高，非常适合工业化规模的量产。非常适合工业化规模的量产。非常适合工业化规模的量产。

【技术实现步骤摘要】
一种基因工程重组表达多肽的系统纯化方法


[0001]本专利技术属于生物制药
，具体涉及一种基因工程重组表达多肽的系统纯化方法。

技术介绍

[0002]生物制药是利用生物活体来生产药物的方法。随着生物技术的发展，人工制备的生物原料成为当前生物制药原料的主要来源。生物制药技术作为战略性新兴产业技术，发展迅猛，在制药工艺中广泛应用。现代生物制药特点是以基因工程为主导，包括细胞工程、发酵工程、酶工程和组织工程等技术的应用。多肽药物是指通过化学合成、基因重组或动植物中提取的具有特定治疗作用的多肽。多肽药物是国内外新药研发的重要方向。融合蛋白是指通过基因重组技术，将两种或多种蛋白质(或其结构域)的编码区连接起来，进行表达产生的一种新蛋白质。
[0003]随着生物制药的发展，基因工程重组蛋白的分离纯化技术显得尤为重要，快速特异地将目标蛋白从复杂的宿主菌中分离纯化出来，要求选择合适的蛋白纯化技术与方法。因为若要研究蛋白质的性质和功能，必须获得纯度较高的蛋白质，如果重组蛋白作为药物使用则需极高的蛋白质纯度，融合标签技术是20世纪末兴起的一种基于报告基因的重组DNA技术，融合标签技术的发展使重组蛋白质的纯化更加快捷，得到广泛应用。常用的蛋白纯化标签包括6X组氨酸(六聚组氨酸)等，即通过基因重组技术把6X组氨酸连接到目标蛋白质的N端融合表达，亲和标签在蛋白质纯化过程中有重要的作用，可以帮助稳定蛋白质和提高蛋白溶解性。纯化系统的选择取决于蛋白质性和下游应用。不同融合标签系统有其共性，也有其各自优点和缺点。融合标签的选择受到多因素制约，比如融合标签系统的纯化条件、融合蛋白自身的性质、纯化基质和缓冲液成本、融合标签的可去除性等，亲和标签被广泛应用于重组蛋白的分离纯化，但后续需要额外的方法去除标签，这极大限制其在工业规模的使用。

技术实现思路

[0004]针对现有技术存在的不足，本专利技术目的是提供一种基因工程重组表达多肽的系统纯化方法，包括利用内含肽自身高效的剪切反应，把目标蛋白和亲和标签断裂分离。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种基因工程重组表达多肽的系统纯化方法，包括以下步骤：
[0006]S110：重组表达菌体的裂解：先用菌体裂解缓冲液A将湿重的菌体进行重悬，以叶片式搅拌器搅拌均匀，实验在冰浴中操作，然后使用均质机，将搅拌均匀的菌体重悬液进行高压均质，完成高压均质后，将菌体裂解液离心，收集上清，最后用深层滤膜过滤。
[0007]S120：镍离子柱纯化步骤：采用镍离子纯化胶体填充层析柱，以五倍于柱体积平衡缓冲液B平衡柱子，菌体裂解液上样量为八倍于柱体积，然后以七倍于柱体积平衡缓冲液B洗涤，最后用八倍于柱体积洗脱缓冲液C洗脱柱进行目的产物的收集。
[0008]S130：重组表达菌体的裂解的自裂解过程；将镍离子柱洗脱下来的样本称重定量，然后用蠕动泵缓慢泵入缓冲液D中，进行稀释并调节pH至10.0，放置于25℃恒温箱中自裂解反应，然后离心收集上清，最后用滤膜过滤。
[0009]S140：疏水层析纯化步骤：采用疏水层析胶体填充层析柱，以五倍于柱体积的平衡缓冲液E平衡柱子，裂解过滤液上样体积十倍于柱体积，然后以五倍于柱体积平衡缓冲液E洗涤纯化柱，最后以四倍于柱体积的纯化水洗脱收集目的产物，并加入浓度20mM的碳酸氢铵，调节pH至9.0。
[0010]S150：反相色谱纯化步骤：采用反相色谱介质填充层析柱，以二倍于柱体积的平衡缓冲液平衡柱子，向疏水层析纯化步骤收集的洗脱液中加入终浓度为10％的乙醇，并上样体积1300mL，然后以二倍于柱体积的平衡缓冲液洗涤柱子，最后以缓冲液F与缓冲液G拉线性梯度洗脱。
[0011]S160：切向流超滤浓缩：将反相色谱纯化收集到的样本进行切向流系统超滤，以一进一出的方式，使用相当于渗过流率的流速加入缓冲液H进行连续式稀释，共置换十倍的反相色谱纯化步骤所洗脱的体积。
[0012]优选的，所述重组表达菌体裂解所采用的缓冲液A为2mM乙二胺四乙酸、25mM咪唑、50mM磷酸钾和300mM氯化钠的混合溶液，且缓冲液A的酸碱度为pH7.0。
[0013]优选的，所述镍离子柱纯化步骤中所采用的平衡缓冲液B为25mM咪唑、50mM磷酸钾和300mM氯化钠的混合溶液，且平衡缓冲液B的酸碱度为pH7.0。
[0014]优选的，所述镍离子柱纯化步骤中所采用的柱洗脱缓冲液C为400mM咪唑、50mM磷酸钾和300mM氯化钠的混合溶液，且柱洗脱缓冲液的酸碱度为pH7.0。
[0015]优选的，所述自裂解步骤中所采用的裂解缓冲液D为50mM磷酸钾缓冲液，且裂解缓冲液D的酸碱度为pH10.0。
[0016]优选的，所述疏水层析纯化步骤中所采用的平衡缓冲液E为50mM磷酸钾缓冲液和120Mm氯化钠的混合溶液，且平衡缓冲液E的酸碱度为pH10.0。
[0017]优选的，所述疏水层析纯化步骤中所采用的洗脱液为纯化水。
[0018]优选的，所述反相色谱纯化步骤中所采用的平衡缓冲液F为20mM碳酸氢铵溶液，且平衡缓冲液F的酸碱度为pH8.0。
[0019]优选的，所述反相色谱纯化步骤中所采用的洗脱缓冲液G为20mM碳酸氢铵溶液，且洗脱缓冲液G的酸碱度为pH8.0。
[0020]优选的，所述切向流超滤浓缩步骤中所采用的浓缩置换缓冲液H为10mM碳酸氢铵，且浓缩置换缓冲液H的酸碱度为pH9.0。
[0021]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0022]1、通过重组表达菌体裂解方法中的均质破菌方法，经过5次重复实验，蛋白凝胶电泳分析结果表明重组表达菌体基本全部破菌裂解，按镍离子柱纯化步骤，经过5次重复实验，蛋白凝胶电泳分析结果表明经过镍离子柱纯化后，含有6X组氨酸标签的基因工程重组蛋白被分离纯化收集，按内含肽自裂解步骤，经过5次重复实验，蛋白凝胶电泳分析结果表明重组表达目的蛋白全部完成自裂解。
[0023]2、通过按实验步骤所述的疏水层析纯化方法，经过5次重复实验，蛋白凝胶电泳分析和高效液相色谱分析表明疏水层析纯化效果良好，按实验步骤所述的反相色谱纯化方
法，经过5次重复实验，蛋白凝胶电泳分析和高效液相色谱分析表明反相色谱纯化方法效果良好，按实验步骤所述的切向流超滤浓缩方法，经过5次重复实验，高效液相色谱分析表明切向流超滤浓缩效果良好。
[0024]3、通过该基因工程重组表达多肽的系统纯化方法，可获得重组多肽的纯度高达97％以上。获得重组多肽的纯度高，非常适合工业化规模的量产。
附图说明
[0025]图1为本专利技术的基因工程重组表达多肽的系统纯化方案步骤示意图；
[0026]图2为本专利技术的蛋白凝胶电泳分析重组表达菌体的裂解示意图；
[0027]图3为本专利技术的蛋白凝胶电泳分析镍离子柱纯化示意图；
[0028]图4为本专利技术的蛋白凝胶电泳分析内含肽的自裂解示意图；
[0029]图5为本专利技术的蛋白凝胶电泳分析分析疏水层析纯化效果示意图；...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基因工程重组表达多肽的系统纯化方法，其特征在于：包括以下步骤：S110：重组表达菌体的裂解：先用菌体裂解缓冲液A将湿重的菌体进行重悬，以叶片式搅拌器搅拌均匀，实验在冰浴中操作，然后使用均质机，将搅拌均匀的菌体重悬液进行高压均质，完成高压均质后，将菌体裂解液离心，收集上清，最后用深层滤膜过滤；S120：镍离子柱纯化步骤：采用镍离子纯化胶体填充层析柱，以五倍于柱体积平衡缓冲液B平衡柱子，菌体裂解液上样量为八倍于柱体积，然后以七倍于柱体积平衡缓冲液B洗涤，最后用八倍于柱体积洗脱缓冲液C洗脱柱进行目的产物的收集；S130：重组表达菌体的裂解的自裂解过程：将镍离子柱洗脱下来的样本称重定量，然后用蠕动泵缓慢泵入缓冲液D中，进行稀释并调节pH至10.0，放置于25℃恒温箱中自裂解反应，然后离心收集上清，最后用滤膜过滤；S140：疏水层析纯化步骤：采用疏水层析胶体填充层析柱，以五倍于柱体积的平衡缓冲液E平衡柱子，裂解过滤液上样体积十倍于柱体积，然后以五倍于柱体积平衡缓冲液E洗涤纯化柱，最后以四倍于柱体积的纯化水洗脱收集目的产物，并加入浓度20mM的碳酸氢铵，调节pH至9.0；S150：反相色谱纯化步骤：采用反相色谱介质填充层析柱，以二倍于柱体积的平衡缓冲液平衡柱子，向疏水层析纯化步骤收集的洗脱液中加入终浓度为10％的乙醇，并上样体积1300mL，然后以二倍于柱体积的平衡缓冲液洗涤柱子，最后以缓冲液F与缓冲液G拉线性梯度洗脱；S160：切向流超滤浓缩：将反相色谱纯化收集到的样本进行切向流系统超滤，以一进一出的方式，使用相当于渗过流率的流速加入缓冲液H进行连续式稀释，共置换十倍的反相色谱纯化步骤所洗脱的体积。2.根据权利要求1所述的一种基因工程重组表达多肽的系统纯化方法，其特征在于：所述重组表达菌体裂解所采用的菌体裂解缓冲液A为2mM乙二胺四乙酸、25mM咪唑、5...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐展平，田竣元，何印波，黄娟，吴玉水，
申请(专利权)人：福建基诺厚普生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：