用于鱼类环境DNA监测的12SrRNA通用引物及其应用方法技术

本发明专利技术公开了一种用于鱼类环境DNA监测的12Sr RNA通用引物及其应用方法，涉及分子生态学技术领域。所述的通用引物是基于公共库和本土自建数据库中所有鱼类完整线粒体12Sr RNA基因序列设计、筛选与测试的结果。正向引物和反向引物的5

【技术实现步骤摘要】
用于鱼类环境DNA监测的12Sr RNA通用引物及其应用方法


[0001]本专利技术涉及分子生态学
，尤其涉及一种用于鱼类环境DNA 监测的12Sr RNA通用引物及其应用方法。

技术介绍

[0002]保护水生态系统生物多样性，是改善和提升水生态环境健康的重要举措。摸清水域生态系统生物多样性本底是开展保护工作的前提和基础。鱼类是水域生态系统食物链的重要环节，对鱼类群落多样性监测与研究，不仅能通过可能产生的环境影响响应机制反映水域生态系统的健康水平，而且对正确的开发、调控和管理渔业资源、固碳、对抗气候变化、应对全球粮食安全方面有着重要的意义。
[0003]目前针对鱼类生物多样性现场监测采用的是网、笼、电等捕捞后进行形态学鉴定的方法，该方法费时，费力，精度低，未知物种无法鉴定，且重复性差。而环境DNA（evironmental DNA, eDNA）技术具有采样环节相对方便、简单，对生态无损伤，无需捕获生物活体，无需依赖分类鉴定人员经验，操作通量高、重复性好、结果准确等优点，为水域生态系统鱼类多样性监测提供了强有力的技术支持。
[0004]目前基于eDNA技术的鱼类生物多样性监测，常采用的引物有线粒体Cytb基因、线粒体16S rRNA、线粒体COI基因和12S rRNA等。CN109825563A公开了一种基于环境DNA技术检测鱼类物种多样性的方法，该方法中公开的CytbF/R和16SF/R引物对，检测精度好但物种的检测范围受到限制，部分物种无法监测到；CN104531879A公开了一种用于鱼类群落结构研究的环境DNA鉴定方法，该方法提及的鱼类COI通用引物对某些物种无法进行扩增，而且产物平均长度为608bp，不适合Ion Torrent二代测序仪的读长，这也直接限制了基于Ion Torrent二代测序仪平台的COI通用引物在鱼类多样性中的应用；CN113355403A公开了一种利用环境DNA技术检测鱼类物种多样性的方法，该申请公开的12S rRNA，其扩增循环数为55，过高的循环数增加了非特异性扩增风险，不利于文库的筛选，也会导致后期假阳性的增加；CN109943645A公开了一种淡水鱼类线粒体12S通用宏条形码扩增引物及其应用方法，该方法共设计出10种引物对，可以满足不同测序平台的需求，而且能高效扩增多种淡水鱼，满足一定的淡水鱼监测需求，然而本申请人通过信息手段模拟PCR分析发现，Fish
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F2、Fish
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F4对应的引物组合覆盖度和区分度均较低，Fish
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F3和Fish
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F6对应的引物组合其区分度可达100%，但物种覆盖度却较低，Fish
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F1对应的引物组合覆盖度和区分度尚需改进；而且在部分水域，其通用引物按照所公开的PCR扩增条件，核酸PCR扩增无条带，故其公开的引物组合并不能满足所有水域监测需求。

技术实现思路

[0005]为了克服现有技术的不足, 本专利技术的目的是提供一种用于鱼类环境DNA 监测的12Sr RNA通用引物及其应用方法，针对不同水域系统，采用设计的鱼类12Sr RNA通用引物，具有通用性好，覆盖度广、区分度高的优点，能实现不同水环境DNA中鱼类多样性的精准监
测。
[0006]一种用于鱼类环境DNA监测的12SrRNA通用引物设计方法，a.采用了公共数据库中的鱼类数据库中的所有的鱼类完整线粒体12SrRNA序列，所述的公共数据库包括NCBI、MitoFish，和浙江省本土自建鱼类数据库；b.通过ClustalW软件进行多序列比对分析，对保守区域采用PrimerPremier5设计软件设计出多组引物对；c.从信息分析层面，对上述多对引物对进行鱼类PCR扩增模拟，比较筛选出多组待测试的引物对，所述的比较筛选的考虑因素包括覆盖度、区分度、扩增片段长度；d.对上述比较筛选出多组待测试的引物对进行实验测试，最终筛选出优选的一组或者多组引物对。
[0007]一种用于鱼类环境DNA监测的12SrRNA通用引物，采用所述的12SrRNA通用引物设计方法设计，最终筛选出所述引物序列为：正向引物TK_12S
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F：TCGTGCCAGCHRCCGCGGT，如SEQIDNO1所示；反向引物TK_12S
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R：ARTRGGGTMTCTAATCCYAG，如SEQIDNO2所示。
[0008]所述的正向引物和反向引物的5
’
端分别添加不同的功能核苷酸序列得到建库引物，用于一步法PCR扩增建库和IonTorrent二代测序仪测序；所述的建库引物的正向引物的各部分组成如下：用于识别IonTorrent二代测序仪的正向固定核苷酸序列，如SEQIDNO3所示；核苷酸序列标签；接头核苷酸序列，GGTGAT；TK_12S
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F，如SEQIDNO1所示；所述的建库引物的反向引物由用于识别IonTorrent二代测序仪的反向固定核苷酸序列，如SEQIDNO4所示，TK_12S
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R，如SEQIDNO2所示组成；不同样本的建库引物采用不同的所述的建库引物的正向引物，采用相同的所述的建库引物的反向引物。
[0009]所述的建库引物的正向引物包括正向建库引物1至23，分别如SEQIDNO5至SEQIDNO27所示，所述的建库引物的反向引物如SEQIDNO28所示。
[0010]一种根据所述的通用引物用于鱼类环境DNA监测的应用方法，包括以下步骤：步骤一，水样采集、富集和环境DNA的提取；步骤二，PCR扩增反应体系中模板为环境DNA，引物为所述的建库引物中的一组正、反向引物对；PCR扩增条件采用两步梯度法，为95℃预变性5min；5个循环包括95℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸30s；30个循环包括95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s；72℃终延伸5min；步骤三，PCR扩增产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，采用天根琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，对PCR产物目的条带进行割胶回收纯化，并Qubit检测文库浓度；步骤四，将筛选的文库混合后，在IonTorrent二代测序仪上进行高通量测序；步骤五，对测序数据去除潜在的污染序列、接头和barcode序列后，使用QIIME对数据进行N较多或者低质量序列过滤，再进行嵌合体过滤，得到可用于后续分析的有效数据，采用DADA2算法对有效数据进行聚类，获得ASV，对比公共数据库和本土数据库进行物种鉴定与注释，得到鱼类物种组成结构信息。
[0011]所述的PCR扩增产物长度为194～221bp。
[0012]所述的用于鱼类环境DNA监测的12SrRNA扩增引物的应用方法，所述步骤三中，文库的PCR扩增产物长度为282～309bp。
[0013]本专利技术的有益效果：
本专利技术基于对鱼类公共数据库结合本实验室鱼类本土自建鱼类数据库中大量的鱼类完整线粒体12S序列，进行引物设计，并模拟PCR扩增情况，从覆盖度、区分度、扩增片段长度等方面进行本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
bp。7. 根据权利要求5所述的用于鱼类环境DNA监测的12Sr RNA扩增引物的应用方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘洋，洪文杰，王焕英，毛朋阳，王庭璋，张力，
申请(专利权)人：浙江天科高新技术发展有限公司，
类型：发明
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