基于多重荧光探针法qPCR的支原体检测试剂盒及其应用方法技术

本发明专利技术涉及微生物检测技术领域，旨在提供一种基于多重荧光探针法qPCR的支原体检测试剂盒及其应用方法。该试剂盒，包括：支原体检测反应缓冲液；引物和探针组混合液；其引物序列如SEQ ID NO.1

【技术实现步骤摘要】
基于多重荧光探针法qPCR的支原体检测试剂盒及其应用方法


[0001]本专利技术属于微生物检测
，具体涉及一种基于多重荧光探针法qPCR的支原体检测试剂盒及其应用方法，该试剂盒涉及特异性检测支原体的引物、探针及优化的反应体系。

技术介绍

[0002]支原体属于柔膜菌纲，大小介于细菌和病毒之间；可在无生命培养基中生长繁殖的最小原核细胞型微生物，没有细胞壁，大小约0.1
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0.8μm，是细胞培养中的常见污染物。支原体容易通过标准灭菌过滤器，较难清除。支原体含有多个质粒，质粒与转座子共同编码产生抗药性，导致其容易对抗菌药物产生耐药性。支原体污染具有隐蔽性，培养基一般不浑浊，常规光学显微镜下无法观察到。实际上此时细胞生长已受到抑制，并能导致染色体畸变等。由于对细胞培养实验的结果影响巨大，因此在生物制药企业或科研机构的研发过程中，凡涉及细胞培养的过程都需要进行支原体的检测，以确保放行产品和科研用细胞都不含支原体。
[0003]目前我国药典规定的支原体检测的方法包括培养法和指示细胞培养法。以上2种检测方法通常耗时较长，如培养法至少28天。近年来，细胞治疗药物发展快速，且其上市周期快，货架期短，培养法和指示细胞法均无法满足药物放行的时间要求，因此迫切需求一种快速、高效支原体检测方法。
[0004]核酸法作为一种替代方法，已得到美国、欧洲、英国以及日本药典的认可，并将核酸法验证要求的相关标准写入药典。市面上也陆续出现一些核酸法检测支原体的试剂盒，但能够覆盖的支原体种类较少。
[0005]基于上述原因，本专利技术基于多重荧光探针法qPCR设计支原体特异性引物及探针组，并优化反应体系，构建了一种快速、高效及支原体检测种类覆盖范围更广的试剂盒。

技术实现思路

[0006]本专利技术要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种基于多重荧光探针法qPCR的支原体检测试剂盒及其应用方法。
[0007]为解决技术问题，本专利技术的解决方案是：
[0008]提供一种基于多重荧光探针法qPCR的支原体检测试剂盒，包括：支原体检测反应缓冲液；引物和探针组混合液；其引物序列如SEQ ID NO.1
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10所示，探针序列如SEQ IDNO.11
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14所示；阳性对照是将支原体阳性样本克隆获得目的基因片段，然后连接至pUC57载体上获得阳性标准质粒；阴性对照是为不含有核酸的DNA稀释缓冲液；内部质控包含参考基因的大肠杆菌基因组DNA，该参考基因是将随机合成的DNA片段转座至大肠杆菌基因组获得的。随机合成片段与NCBI上序列都不具有序列同源性，适合作为内部控制序列。
[0009]作为本专利技术的优选方案，所述DNA稀释缓冲液具体是指：25mM Tris
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HCl，pH 8.0，150mM NaCl的Tris
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HCl缓冲液。该缓冲液中不含有核酸，不包含支原体基因组DNA。
oxytoca、保加利亚乳杆菌Lactobacillus bulgaris、伊氏利斯特菌Listeria ivanovii、李斯特菌L.monocytogenes、铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa、痢疾志贺氏菌Shigella dysenteriae、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、粪链球菌Streptococcus faecalis、耶尔森菌Yersinia enterocolitica、毕赤酵母Pichia pastoris，进行序列比对，筛选支原体特异性的区段，寻找两端特异中间保守的区段，设计引物，并在NCBI上进行Primer
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BLAST引物序列比对，分析引物的特异性，并外送合成引物。根据探针设计的原则，在扩增片段的中间保守区域设计探针，设计长度为25
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32bp的探针，在探针的5
’
端加上荧光基团FAM，3
’
端加上猝灭基团BHQ1，并外送合成探针。引物和探针组的序列信息如表1。
[0025]表1支原体和内控特异性引物和探针组
[0026][0027][0028]本专利技术采用多个支原体特异性引物组合的做法能够覆盖较多的支原体种类。通过Primer
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BLAST统计，可检测超过180余种支原体，能检测到的支原体种类覆盖度高于现有方法。
[0029]实施案例2:试剂盒的体系配制、检测步骤及结果判定标准
[0030]本专利技术提供的试剂盒中，包括：支原体检测反应缓冲液(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)、引物和探针组混合液(Primer&Probe Mix)、阳性对照(Positive control,PC)、内部质控(Internal control，IC)以及可作为阴性对照的DNA稀释缓冲液(DNA Diluted Buffer)。
[0031]将本专利技术的试剂盒用于多重荧光探针法qPCR检测的方法，具体包括以下步骤：
[0032](1)配制多重荧光qPCR反应体系：10μl支原体检测反应缓冲液，5μl的引物和探针混合液，1μl内部质控IC，最后加入4μl的待测样品、阳性对照及阴性对照，反应体系的终体积为20μl。
[0033](2)将步骤(1)中的多重荧光探针qPCR反应体系轻微震荡混匀，并离心，避免气泡。
[0034](3)对步骤(2)中的qPCR反应体系进行扩增；创建FAM探针，选择荧光报告基团为FAM，荧光猝灭基团为none；创建Cy5探针，选择荧光报告基团为Cy5，荧光猝灭基团为none；
采用两步法PCR反应，扩增程序设置为：94℃预变性10min，95℃循环反应10sec，60℃反应30sec，设置为45个循环。
[0035]以ABI 7500Fast为例：
[0036]创建FAM探针，选择荧光报告基团为FAM，荧光猝灭基团为none；创建Cy5探针，选择荧光报告基团为Cy5，荧光猝灭基团为none；选择检测参比荧光为ROX(可选择)；扩增程序设置为：预变性94℃10min，循环反应95℃10s，60℃30s，设置为45个循环；Volume选择20μl。qPCR反应后，使用7500Software v2.3软件进行结果分析。每个反应重复3次。
[0037]结果判定标准：对于质控样品，阴性和阳性对照的Cy5信号通道的Ct值均小于40且有有效的“S”型扩增曲线，阳性对照的FAM信号通道的Ct小于40且有有效的“S”型扩增曲线，阴性对照的FAM信号通道的Ct大于或等于40或者扩增曲线无明显起峰。
[0038]以上qPCR反应程序采用两步法，整个程序反应时长约为67min，市面上支原体检测试剂盒多采用三步法，整个程序反应时长约需2.5h，因此进一步缩短了检测时长。
[0039]实施案例3:标准曲线绘制
[0040]将阳性标准质粒进行梯度稀释，稀释拷贝数浓度分别为106、105、104、103、1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于多重荧光探针法qPCR的支原体检测试剂盒，其特征在于，包括：支原体检测反应缓冲液；引物和探针组混合液；其引物序列如SEQ ID NO.1
‑
10所示，探针序列如SEQ ID NO.11
‑
14所示；阳性对照是将支原体阳性样本克隆获得目的基因片段，然后连接至pUC57载体上获得阳性标准质粒；阴性对照是为不含有核酸的DNA稀释缓冲液；内部质控包含参考基因的大肠杆菌基因组DNA，该参考基因是将随机合成的DNA片段转座至大肠杆菌基因组获得的。2.根据权利要求1所述的支原体检测试剂盒，其特征在于，所述DNA稀释缓冲液具体是指：25...

【专利技术属性】
技术研发人员：谷启娟，王庭璋，王焕英，钟啸萍，张力，王美霞，刘慧君，杨堃，方穹，赵红霞，
申请(专利权)人：浙江天科高新技术发展有限公司，
类型：发明
国别省市：