GeXP多重基因表达遗传分析系统在手足口病病原分型检测中的应用技术方案

本发明专利技术属于生物技术应用领域，涉及各级疾病预防控制机构，哨点医院等用于手足口病患者咽拭子和粪便等标本的多种肠道病毒(包括HEV71，CVA16，CVA4，CVA5，CVA9，CVA10，CVB1，CVB3和CVB)感染的同时检测和分型。具体在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/下载各种血清型的人肠道病毒VP1区核苷酸序列和所有肠道病毒5’UTR保守片段，设计各个血清型特异性引物和肠道通用引物，进行单管多重(10重)PCR检测9种肠道病毒和所有肠道病毒5’UTR保守片段，整个反应不到2个小时。本专利既克服了常规单管多重荧光定性PCR检测不能分型的缺点，也克服了常规芯片检测方法的操作繁琐，时间较长，成本较高等缺点，为肠道病毒分型技术提供了新的思路，其高特异性、高灵敏度、快速的特点为手足口病相关肠道病毒的快速准确筛查和分型提供了有力的技术支撑，对研究我国手足口病患者感染病原谱和分子流行病学调查有重要意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物技术应用领域，涉及各级疾病预防控制机构，哨点医院等用于手足口病患者咽拭子和粪便等标本的多种肠道病毒(包括HEV71，CVA16，CVA4，CVA5，CVA9，CVA10,CVB1,CVB3和 CVB)感染的同时检测和分型。具体在http://www. ncbi. nlm. nih. gov/nucleotide/下载各种血清型的人肠道病毒VPl区核苷酸序列和所有肠道病毒5’UTR保守片段，设计各个血清型特异性引物和肠道通用引物，进行单管多重(10重)PCR检测9种肠道病毒和所有肠道病毒5’ UTR保守片段，整个反应不到2个小时。本专利既克服了常规单管多重荧光定性PCR检测不能分型的缺点，也克服了常规芯片检测方法的操作繁琐，时间较长，成本较高等缺点，为肠道病毒分型技术提供了新的思路，其高特异性、高灵敏度、快速的特点为手足口病相关肠道病毒的快速准确筛查和分型提供了有力的技术支撑，对研究我国手足口病患者感染病原谱和分子流行病学调查有重要意义。
技术介绍
手足口病(Hand-Foot-and-Mouth Disease,HFMD)是由一组人肠道病毒引起的，临床表现以发热和手、足、口腔和臀部等部位出现皮疹为主要临床特征的一种常见的急性传染病。少数病例可出现心肌炎、脑膜炎、脑炎、肺水肿、循环障碍等，个别重症患儿病情进展快,可导致死亡。引起HFMD的病原体主要为小核糖酸病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属的柯萨奇病毒A组(CoxsackievirusA, CVA)的2、4、5、6、7、8、10、16型,柯萨奇病毒B组(Coxsackievirus B, CVB)的 1-5 型，以及埃可病毒(Echovirus) 1、4、5、6、7、9、11、13、19 型和人肠道病毒71型(Human entervirus71, HEV71)。其中CVA16和HEV71为引起HFMD的主要致病病原体。目前HFMD的实验室检测主要依赖于病毒分离培养、血清学实验和分子生物学实验。病毒分离培养是诊断肠道病毒感染的主要手段和金标准，但是操作步骤复杂，而且一些CVA难以分离，一般实验室没有条件进行这种试验。血清学实验以中和试验和酶联免疫法试验为主，操作步骤相对简单，但是缺点是试剂的质量不一，试验的重复性，以及非特异性的评价尚不完善。近年来，基于TaqMan技术的实时荧光定量-逆转录聚合酶链反应法已成为检测肠道病毒感染的最常用的实验室方法，该方法使用三对引物——肠道通用型引物、HEV71和CVA16特异性引物，分别检测人肠道病毒，HEV71和CVA16，但尚无快速检测HFMD其它病原体的分子生物学方法报道。为快速检测HFMD患者中的其它病原体或混合感染的病原体，以阐明我国HFMD患者的病原谱，本研究建立了基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的多重逆转录聚合酶链反应(Multiplex Reverse Transcription-Polymerase ChainReaction, RT-PCR)体系同时快速检测常见的9种引起HFMD的人肠道病毒HEV71，CVA16，CVA4，CVA5, CVA9, CVAlO, CVBI, CVB3和CVB5，并对该方法的特异性和敏感性进行了分析。
技术实现思路
I.查询已在我国疾病控制系统的网络实验室推广使用的肠道病毒通用引物Pan-enterovirus PE2/PE1 和 HEV71、CVA16 的血清型特异性引物 HEV71S/A、CoxA16S/A 序歹丨并在http://www. ncbi. nlm. nih. gov/nucleotide/下载其金7种血清型的人肠道病毒VPl区核苷酸序列，使用ClustalX软件进行多序列比对分析，选择各血清型肠道病毒VPl区相对保守区输入GeXP eXpress Profiler工具设计多重特异性引物(Specific-Primer,SP-Primer)，参考ClustalX比对结果，设置简并碱基。在正、反向特异性引物的5’端分别加入一段非同源性序列作为通用引物标签(Tag)，构成特异性嵌合引物。上游通用引物标签的5’端标记荧光染料Cy5，即Cy5-Tag_F ;下游通用引物标签(Tag-R)不标记荧光。引物信息如表I :表I表IGeXP多重RT-PCR检测9种手足口病相关的肠道病毒引物信息表本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于同时检测手足口病相关肠道病毒HEV71，CVA16，CVA4，CVA5，CVA9，CVA10，CVB1，CVB3和CVB5的多重PCR技术，其中包括：用于检测的各个血清型肠道病毒HEV71，CVA16，CVA4，CVA5，CVA9，CVA10，CVB1，CVB3和CVB5型特异性引物和检测所有肠道病毒的通用引物。

【技术特征摘要】
1.一种用于同时检测手足口病相关肠道病毒HEV71，CVA16，CVA4，CVA5，CVA9，CVAlO,CVBI, CVB3和CVB5的多重PCR技术，其中包括用于检测的各个血清型肠道病毒HEV71，CVA16, CVA4, CVA5, CVA9, CVAlO, CVBI, CVB3和CVB5型特异性引物和检测所有肠道病毒的通用引物。2.权力要求I所述的多重PCR技术的引物和通用引物包括表I所列的基因序列及其每种序列的互补序列或变体。3.权力要求I所述的多重PCR检测技术包括手足口病相关肠道病毒HEV7...

【专利技术属性】
技术研发人员：马学军，胡秀梅，许文波，张勇，聂凯，李瑾，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，
类型：发明
国别省市：