本发明专利技术涉及一种香蕉花叶心腐病毒(Banana?streak?virus，BSV)恒温基因扩增快速检测试剂盒，其试剂包括：由两对引物构成的引物混合液；浓度为8U/μl的Bst?DNA聚合酶；8U的反转录酶；RNA提取液，所述RNA提取液包含：100mM?Tris-HCl(pH7.4)、1M?KC1、10mM?EDTA、和2％(w/v)PVPP；反应缓冲液，所述反应缓冲液包含：10mM?dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mM?MgSO4、5mM甜菜碱＝8∶5∶2∶10；核酸染料；阳性对照：含有香蕉花叶心腐病毒外壳蛋白的cDNA；阴性对照：100mM?Tris-HCl(pH?8.0)和50mMEDTA。本发明专利技术还涉及该试剂盒的使用方法。该试剂盒通过对样品中香蕉花叶心腐病毒的核酸提取、恒温基因扩增反应、最后通过对反应液颜色的肉眼判断来实现对香蕉花叶心腐病毒高特异性、快速、高效、高灵敏度、简便的分子检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物检测领域，具体的说，本专利技术涉及一种香蕉花叶心腐病毒恒温基因扩增快速检测试 剂盒及其使用方法。
技术介绍
香蕉为芭蕉科芭蕉属植物，是热带亚热带重要的经济作物和粮食作物。近年来，我国广东、云南、海南等香蕉主要种植地区先后出现了香蕉花叶心腐病毒(Banana streakvirus, BSV)爆发流行的情况，该病早期症状表现为米粒状的褪绿，随着症状的发展叶片出现断续或连续的褪绿条斑及梭形条斑，并可逐渐发展成坏死黑色条斑，假茎、叶柄及果穗有时也会出现条纹症状。香蕉主要通过无性组织培养エ厂化生产，香蕉花叶心腐病毒可随着组培中香蕉分化芽的繁殖，通过游离病毒形式或病毒基因组整合进香蕉基因组的形式逐代传递，若种苗(或蕉头)携帯香蕉花叶心腐病毒又未经严格检疫，其病原就可能随组培苗以更快的速度传播，成为传播病毒的ー个重要的初侵染源。因此，建立ー套BSV快速、稳定的检测方法是无毒种苗生产的重要保证。近年来，有大量的报道证实基于PCR的方法已经成功用于检测香蕉花叶心腐病毒，PCR方法在操作时间上以及检测的特异性和灵敏度方面较常规方法有较大提高，但是，PCR方法必须有精密的温度循环装置，而且它的检测时间也还是比较长(2 3小吋)，并且反应过程很容易受污染物的影响，从而使得这种方法不能满足实际检测的需要。因此，需要开发ー种灵敏度高并且反应迅速的方法，在一定程度上可以取代PCR的检测方法。因此，将生物技术发展的最新成果应用于香蕉花叶心腐病毒检测，具有重要意义。DNA 环介导恒温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification ofDNA, LAMP)克服以往基因扩增方法的不足，在等温条件下能够特异性、高效、快速地进行核酸的扩增，具有很多的优越性，见文献Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T,Watanabe K,Amino N，Hase T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. NucleicAcids Res. 2000Jun 15 ；28(12) :E63.。该方法通常是按如下步骤进行步骤一、对被检标本进行预处理，快速提取被检标本的DNA或RNA ;步骤ニ、特异性引物的制备确定待测标本的靶基因后，取得特异性引物2对，内引物和外引物各ー对；步骤三、进行环介导等温扩增技术(LAMP)反应将经前处理的样品、引物、反应缓冲液与Bst DNA聚合酶混合，在63 65°C保温0. 5至I. 5小时进行循环链置换反应；步骤四、分析判断反应产物結果。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述技术缺陷，提供一种香蕉花叶心腐病毒恒温基因扩增快速检测试剂盒。本专利技术的目的还在于提供该香蕉花叶心腐病毒恒温基因扩增快速检测试剂盒的使用方法。为了实现本专利技术的目的，本专利技术提供一种香蕉花叶心腐病毒恒温基因扩增快速检测试剂盒，其试剂包括由两对引物构成的引物混合液，所述两对引物为外引物1-CMV-F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1(AATTCGATTCTACCGTGTGG)所示，外引物2-CMV-B3，其核苷酸序列如SEQ IDNO 2(GACATGAAGTACTAGCTCGTC)所示，内引物 1-CMV-FIP，其核苷酸序列如 SEQ ID NO 3(ACCAGTACCGGTGAGGCTTGCCTCCTCGGACTTATC)所示，内引物 2-CMV-BIP，其核苷酸序列如 SEQID NO 4(TCTGGAGTCCAAGCCAACAACTACGCATGTCACCAATATCAG)所示，所述内引物 1-CMV-FIP和所述内引物2-CMV-BIP的浓度均为40pmol/iil，所述外引物1-CMV-F3和所述外引物2-CMV-B3的浓度分别为5pmol/iil ；浓度为8U/ U I的Bst DNA聚合酶；8U的反转录酶；RNA 提取液，所述 RNA 提取液包含IOOmM Tris-HCl (pH7. 4)、IMKCl、IOmM EDTAjP2% (w/v)PVPP ；反应缓冲液，所述反应缓冲液包含10mM (1见1\10\11161'1110 01反应缓冲液、1501111MgS04、5mM 甜菜碱=8 5 2 10 ；核酸染料； 阳性对照含有香蕉花叶心腐病毒外壳蛋白的cDNA ；阴性对照IOOmMTris-HCl (pH 8. 0)和 50mM EDTA。优选地，所述核酸染料为1000XSYBR Green I。如本文使用的，在反应缓冲液中，“反应缓冲液包含IOmM dNTP、10XThermoPol反应缓冲液、150mM MgS04、5mM甜菜碱=8 :5:2: 10”是指反应缓冲液中IOmM dNTP、10 X ThermoPol反应缓冲液、150mM MgSO4的水溶液、5mM甜菜碱的水溶液的体积比为8 : 5 : 2 : 10。本专利技术还提供一种香蕉花叶心腐病毒恒温基因扩增快速检测试剂盒的使用方法，该方法包括下列步骤I)被检样品的RNA核酸提取向0. 5mg待检测样品中加入30 u IRNA提取液，研磨成糊状后，在95°C IOmin, IOOOOrpm下离心2分钟，取上清作为检测模板RNA ；2)环介导等温扩增反应在25iil PCR管中配置反应溶液1 ii I的外引物1-CMV-F3，其核苷酸序列如SEQID勵1所示；1111的外引物2-01^-83，其核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示；I yl的内弓丨物1-CMV-FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示；I 的内引物2-CMV-BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示；12. 5 ill的反应缓冲液；8U的BstDNA聚合酶I yl ;8U的反转录酶0. 2u l,2u I 的模板 RNA ；然后加水至25iU ;设置阳性对照反应时，用含有香蕉花叶心腐病毒外壳蛋白的cDNA代替I)中得到的检测模板RNA，设置阴性对照反应时，用IOOmM Tris-HCl (pH 8.0)和50mM EDTA代替I)中得到的检测模板RNA，将含有配制好的反应溶液的PCR管于63°C恒温反应90min ；3)分析判断反应产物结果在2)中所得产物中加入I U I的核酸染料，如反应液颜色为橙色，表示结果为阴性，如反应液颜色为绿色，表示结果为阳性。优选地，所述核酸染料为1000XSYBR Green I。本专利技术所述的香蕉花叶心腐病毒恒温基因扩增快速检测试剂盒具有以下有益效果I、高特异性本专利技术根据香蕉花叶心腐病毒基因保守区设计了四条特异性引物，引物序列为SEQ ID NO USEQ ID NO :2、SEQ IDNO :3和SEQ ID NO :4。应用上述四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，阳性率大于95%，假阳性率小于3% ；2、无需高纯度模板DNA :简单快速的DNA提取方法，不需要离心机、液氮、酚、氯仿仪器和试剂；3、实现样品现场检测在野外或田间现场，直接对样本中的条斑病毒进行现场基因扩增检测；4、快速、高效扩增扩增在不到I小时即可完成，且产率高；5、灵敏度高在复杂体系中可检测到单个细胞的靶本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种香蕉花叶心腐病毒恒温基因扩增快速检测试剂盒，其特征在于，其试剂包括 由两对引物构成的引物混合液，所述两对引物为外引物1-CMV-F3，其核苷酸序列如SEQ ID ■:1所示，外引物2-01^-83，其核苷酸序列如5￡0 ID勵:2所示，内引物1-01^+1卩，其核苷酸序列如SEQ ID勵:3所示，内引物2-01^-81 ，其核苷酸序列如5￡010 NO:4 ^示，所述内引物I-CMV-FIP和所述内引物2-CMV-BIP的浓度均为40pmol/yl，所述外引物1-CMV-F3和所述外引物2-CMV-B3的浓度分别为5pmol/iil ； 浓度为8U/ u I的Bst DNA聚合酶； 8U的反转录酶； RNA 提取液，所述 RNA 提取液包含IOOmM Tris-HCl (pH7. 4)、IM KClUOmM EDTAjP2%(w/v) PVPP ； 反应缓冲液，所述反应缓冲液包含10mM dNTPUOXThermoPol反应缓冲液、150mMMgS04、5mM 甜菜碱=8:5:2:10 ； 核酸染料； 阳性对照含有香蕉花叶心腐病毒外壳蛋白的cDNA ； 阴性对照100mM Tris-HCKpH 8. 0)和 50mM EDTA。2.根据权利要求I所述的香蕉花叶心腐病毒恒温基因扩增快速检测试剂盒，其特征在于，所述核酸染料为1000XSYBR Green I。3.一种香蕉花叶心腐病毒恒温基因扩增快速检测试剂盒的使用方法，该方法...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄俊生，彭军，郭建荣，郭立佳，杨腊英，王国芬，梁昌聪，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：
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