乙肝乙脑双价疫苗制造技术

本发明专利技术公开了一种预防和治疗流行性乙型脑炎（又称日本脑炎，简称“乙脑”）和乙型肝炎（简称“乙肝”）的乙肝乙脑双价疫苗。此双价疫苗由乙肝病毒抗原基因插入到减毒乙脑病毒的基因组中构建而成，既能以减毒乙脑病毒为载体高效率地表达乙肝病毒的抗原，又保持了乙脑减毒活疫苗的安全性和免疫原性，因而是一种能够同时预防和治疗乙脑和乙肝的双价疫苗。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因重组领域，具体地涉及以乙脑病毒为载体构建的重组病毒疫苗。
技术介绍
乙脑(Japanese encephalitis)和乙肝(Hepatitis B)均为亚洲多发的传染性疾病。乙脑是由乙脑病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)感染引起，病死率接近40％，10％～30％的幸存者留有严重的永久性神经学后遗症。目前，全世界有两类获得上市许可的乙脑疫苗灭活疫苗和减毒活疫苗。乙脑减毒活疫苗实质上是一种活的减毒乙脑病毒(live attenuated JEV)，我国选用的毒株为SA14-14-2，它于1988年在我国获得上市许可，目前为止已有约2亿儿童使用，一次免疫的有效率达95％，两次免疫的有效率达98％，无严重副反应，保护期长达30年以上，其安全性和有效性均超过了灭活疫苗。并且，乙脑减毒活疫苗的免疫费用远低于灭活疫苗，应用减毒活疫苗比灭活疫苗节约47％的免疫费用(Ding Ding，et al.Cost-effectivess of routine immunization to control Japanese encephalitis inShanghai，China.Bulletin of the World Health Organization 2003，81(5)334-342)。已有一些亚洲国家开始进行乙脑减毒活疫苗的临床试验，如韩国、尼泊尔等。乙脑减毒活疫苗的安全、高效，显示出其作为基因治疗载体的美好前景，但由于乙脑减毒活疫苗近几年才逐步获得国际上的认可，以及其RNA基因组重组技术的复杂性，迄今为止，尚无任何以乙脑减毒活疫苗为载体的生物制品的研究报道。乙肝是广泛存在于亚洲的、危害最严重的传染性疾病。现在，乙肝病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染已成为世界性的健康问题，全球HBV感染者约3亿，每年约100万感染者死于肝硬化或肝癌等HBV相关疾病。中国是乙肝高发区，约有1亿HBV感染者，部分地区感染率可高达14.29％，每年约有30万人死于肝硬化或肝癌，每年报告的急性肝炎病例约270万，其中10％～30％为急性乙肝病例。乙肝疫苗是预防和控制HBV感染的重要手段。现在，国际市场上的乙肝疫苗基本均为基因工程HBV亚单位疫苗，其安全性和有效性及已得到充分的证实，但生产成本较高，且需接种3次(即第一次接种后1个月和6个月各接种一次)。另外乙肝疫苗的有效保护率为80-95％，免疫后体内保护性抗体浓度逐年下降，7年后约有30～50％的免疫者体内基本检测不到抗体，因此，乙肝疫苗一般应每隔5～7年重复免疫一次。据1999年底由卫生部疾控司、中国预防医科院全国计划免疫指导中心联合组织的调查结果，全国新生儿乙肝疫苗平均接种率达70.7％，其中城镇接种率88.5％，农村62.7％。从总体看，我国仍有近1/3新生儿在乙肝免疫保护之外，而且全国平均第一针及时接种率(出生24小时之内接种)仅有29％，平均全程合格接种率仅有28.4％。接种不及时和未全程接种的情况，农村明显比城市严重。影响乙肝疫苗效果和普及的主要原因在于疫苗成本较高、需多次重复免疫。目前，国际上正在开发的乙肝疫苗种类有合成肽疫苗、DNA疫苗以及以沙门氏菌(Salmonella)为载体的基因工程疫苗等，然而这些乙肝疫苗在免疫效率和生产成本等方面还不令人满意。因此，本领域迫切需要开发免疫效率高、生产成本低的新型疫苗。
技术实现思路
本专利技术提供了基于减毒乙脑病毒的新型疫苗。在本专利技术的第一方面，提供了一种重组乙脑病毒，所述的重组乙脑病毒由乙脑病毒衣壳和重组乙脑病毒基因组构成，所述的乙脑病毒基因组中插入了外源核酸序列，且重组后的基因组保留了自我复制功能。在另一优选例中，所述的外源核酸中含有编码抗原、抗原决定簇、细胞因子、生长因子、多肽类激素、酶、受体、抗体和/或癌相关蛋白的核酸序列。在另一优选例中，所述的外源核酸序列含有乙肝病毒抗原或抗原决定簇的核酸序列。在另一优选例中，外源核酸的插入位点选自下组(i)在乙脑病毒基因组的NS2B和NS3编码区之间；(ii)在乙脑病毒基因组的E和NS1编码区之间；(iii)在乙脑病毒基因组的C和prM编码区之间。在另一优选例中，所述的乙脑病毒基因组缺失了部分乙脑病毒结构蛋白基因序列。更佳地，所述缺失的结构蛋白基因序列选自下组C蛋白、prM蛋白、E蛋白或其组合。在另一优选例中，所述的乙脑病毒是减毒的，例如毒株SA14-14-2。在本专利技术的第二方面，提供了本专利技术所述的重组乙脑病毒的用途，它被用于制备治疗性或预防性的疫苗，尤其是制备用于防治乙脑和乙肝的双价疫苗。在本专利技术的第三方面，提供了一种药物组合物，它含有本专利技术所述的重组乙脑病毒和药学上可接受的载体。在本专利技术的第四方面，提供了一种制备重组乙脑病毒的方法，包括步骤(a)将乙脑病毒基因组引入包装细胞，其中所述的乙脑病毒基因组中插入了外源核酸序列，且缺失了选自下组的结构蛋白基因序列C蛋白、prM蛋白、E蛋白或其组合，并且重组后的基因组保留了自我复制功能而所述的包装细胞选自下组(i)被含所述病毒缺失的结构蛋白基因的质粒转染的细胞， (ii)被含所述病毒缺失的结构蛋白基因的辅助病毒载体转染的细胞，和(iii)基因组整合有所述病毒缺失的结构蛋白基因的细胞；(b)培养步骤(a)的包装细胞；(c)从培养物中分离出重组乙脑病毒。当乙脑病毒基因组不缺失结构蛋白时，将其直接引入可被乙脑病毒感染的宿主细胞即可生产得到重组乙脑病毒。本领域技术人员可以从下文更详细的描述中理解本专利技术的目的、优点、实施方式等具体内容。附图说明图1为乙脑病毒的RNA基因结构示意图。图2为把乙脑病毒RNA转化成四段乙脑病毒cDNA片段的流程图。图3为制备全长的乙脑病毒cDNA克隆的流程图。图4为制备插入点在NS2B和NS3之间的双价疫苗的流程图。图5为制备插入点在E和NS1之间的双价疫苗的流程图。图6为制备插入点在C和prM之间的双价疫苗的流程图。图7为制备含有JEV亚基因组的乙肝乙脑双价疫苗的流程图。具体实施例方式本专利技术提供了重组乙脑病毒的构建和应用方法，在减毒乙脑病毒基因组中插入了外源(即非JEV)核酸序列，且外源核酸序列的插入不影响基因组的自我复制功能。本专利技术提供的这种重组乙脑病毒，不仅具有乙脑减毒活疫苗的全部免疫活性，而且能在使用者(患者、易感人群等)体内表达外源核酸产生外源多肽。这种重组乙脑病毒能引发使用者机体对外源多肽的免疫应答，进而达到预防和/或治疗外源多肽相关疾病的作用。本专利技术所述的乙脑病毒基因组，可以是全基因组，也可以是缺失部分核酸序列的亚基因组。在本专利技术的一个实施方案中，所述的乙脑病毒基因组是全基因组。在本专利技术的另一个实施方案中，所述的乙脑病毒基因组是缺失了部分结构蛋白基因序列的亚基因组，其中，缺失的结构蛋白基因序列选自下列基因C蛋白、prM蛋白、E蛋白或其组合。本专利技术所述的外源核酸序列，可以编码一种或几种多肽，编码的多肽类型包括但不限于抗原或其决定簇、细胞因子、癌相关蛋白、生长因子、多肽类激素、受体、酶、抗体等。如果外源核酸含有编码某种病原的抗原或抗原决定簇的序列，则该重组乙脑病毒可以激发人体对JEV和该病原的免疫应答，起到同时预防和/或治疗本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组乙脑病毒，其特征在于，所述的重组乙脑病毒由乙脑病毒衣壳和重组乙脑病毒基因组构成，所述的乙脑病毒基因组中插入了外源核酸序列，且重组后的基因组保留了自我复制功能。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：庞小伍，
申请(专利权)人：上海天甲生物医药有限公司，美国天甲生物医药有限公司，北京东方天甲科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]