本发明专利技术公开了一种多刺多毛植物外植体的消毒灭菌方法，包括以下步骤：(1)、将外植体按常规流水冲洗表面灰尘，除去游离水，按常规用酒精表面消毒；(2)、将装有外植体与消毒杀菌液的容器放入连接有抽气泵的真空干燥器中，创造负压环境，使外植体多毛多刺部位形成的顽固气泡破裂，气体逸出，彻底清除藏菌死角，保证消毒杀菌液浸润到外植体所有的表面，快速、安全、高效获得多毛多刺外植体无菌材料。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物的组织培养领域，具体涉及一种多刺多毛植物外植体的消毒灭菌 方法。 技术背景 业内人士共知，能否获得无菌材料是决定植物组织培养工作能否真正开始和继续 进行的第一道门槛。而能否对外植体进行成功的消毒灭菌，则是获得无菌材料的首要环节。 一般的植物外植体，通过流水冲洗，次氯酸钠、酒精、升汞、洗衣粉、吐温，等杀菌剂与表面活 性剂的配合使用，即可取得较好的消毒灭菌效果。但是，对于那些表面多刺多毛的外植体， 特别是在毛、刺比较密集的部位（例如花蕾、包有多层鳞片的休眠芽和仙人掌类的茎段， 等），由于灭菌液体表面张力的存在，很容易在刺毛间产生顽固的气泡，形成灭菌剂无法触 及的"死角"，即使加入足够多的强力表面活性剂吐温，加上反覆地摇动，也成效甚微。最终 导致外植体的污染率极高，甚至全军覆没，造成材料、人力和试剂的严重浪费。如果是珍稀 的外植体材料，更会令人心痛不已。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种创造负压环境使气泡破裂逸出气体，彻底清 除藏菌死角，保证灭菌液充分浸润到外植体的每一部分，快速、安全、高效获得多刺多毛植 物外植体无菌材料的多刺多毛植物外植体的消毒灭菌方法。 本专利技术以如下技术方案解决上述技术问题： ，包括以下步骤： (1)将外植体按常规流水冲洗表面灰尘，除去游离水，按常规对外植体进行表面消 毒； (2)将外植体浸泡到用容器装盛的含表面活性剂的消毒杀菌液中，消毒杀菌液的 液面高出外植体Icm以上； (3)将容器放入连接有抽气泵的真空干燥器中，启动抽气泵，抽气时间为2-10分 钟，至没有气体逸出消毒杀菌液的液面时停止抽气，将外植体取出，用无菌水按常规反复洗 涤外植体至无皂泡发生，即获得多刺多毛植物外植体的无菌材料。 所述消毒杀菌液为HgCl2，其质量浓度为0. 1 %。 表面活性剂为吐温，添加量为2- 5滴。 本专利技术的显著优点在于：创造负压环境破坏多毛多刺部位形成的顽固气泡，彻底 清除藏菌死角，保证消毒杀菌液能充分浸润到外植体的每一部分，提高获得多刺多毛外植 体无菌材料的几率，且省时，安全。【具体实施方式】 以下实施例仅用于说明本专利技术，而不是用来限制本专利技术的范围。在未背离本专利技术 精神和实质的情况下，对本专利技术的方法、步骤或创造负压环境的条件所作的修改或替换，均 属于本专利技术的范围。 以仙人掌科植物火龙果的茎段为实验材料： 取火龙果健壮幼嫩的带芽眼茎段作外植体，芽眼处刺毛特别密集。先将三棱茎段 按常规流水冲洗表面灰尘，毛巾除去游离水，棉签沾75%酒精对"茎沟"消毒，沿着"茎沟"纵 向分切，获得单棱茎段，继而再横向分切成单芽眼茎段，每段2cm-3cm，共120段。在2000ml 烧杯中用75%酒精消毒30s后，取出茎段分别移至6个250ml，装有质量浓度为0. 1 %HgCl2 溶液的广口瓶中，每瓶20个茎段，保证溶液液面高过外植体约2cm，每瓶加入5滴吐温-20， 充分摇动。然后分成A，B两大组，每大组3个广口瓶。 A组常规消毒杀菌作对照（CK)，依消毒时间再分为3小组:A-l、A-2、A-3,按常规 在净化工作台上分别消毒杀菌5111；1；1；[11，然后及时用无菌水洗绦外植体6遍，接 种于MS+BA3. 0+NAA0. 1培养基，每瓶培养基接种1个外植体，每小组20瓶。B组为负压处理消毒杀菌，也分为3小组：B-I、B-2、B-3,分别放入3个连接有小型 电动抽气泵的真空干燥器中。启动抽气泵并计时组抽气2min时，不再有气泡逸出，关 闭抽气泵，打开真空干燥器取出广口瓶，在净化工作台上用无菌水洗涤外植体6遍，接种于 上述同样的培养基，每瓶培养基接种1个外植体。B-2组抽气5min，B-3组抽气lOmin，其他 操作同B-I组。 上述A，B两大组材料消毒杀菌后接种于同样的培养基中，并在温度、光照完全相 同的条件下进行常规培养观察，按下列公式定时统计： 污染率=污染茎段数/接种茎段数X100% ; 发芽率=发芽茎段数/接种茎段数X100%(不论污染与否）； 死亡率=死亡茎段数/接种茎段数X100% (不论污染与否）。 其中，死亡率包括污染腐烂死亡和汞中毒死亡。轻度污染仍有发芽可能。 结果见表1。 表1常规消毒灭菌与负压消毒灭菌的效果对比【主权项】1. ，其特征在于，包括以下步骤： (1) 将外植体按常规流水冲洗表面灰尘，除去游离水，按常规对外植体进行表面消毒； (2) 将外植体浸泡到用容器装盛的含表面活性剂的消毒杀菌液中，消毒杀菌液的液面 高出外植体Icm以上； (3) 将容器放入连接有抽气泵的真空干燥器中，启动抽气泵，抽气时间为2-10分钟，至 没有气体逸出消毒杀菌液的液面时停止抽气，将外植体取出，用无菌水按常规反复洗涤外 植体至无皂泡发生，即获得多刺多毛植物外植体的无菌材料。2. 根据权利要求1所述的，其特征在于，所 述消毒杀菌液为HgCl2，其质量浓度为0. 1 %。3. 根据权利要求1所述的，其特征在于，表 面活性剂为吐温，添加量为2- 5滴。【专利摘要】本专利技术公开了，包括以下步骤：(1)、将外植体按常规流水冲洗表面灰尘，除去游离水，按常规用酒精表面消毒；(2)、将装有外植体与消毒杀菌液的容器放入连接有抽气泵的真空干燥器中，创造负压环境，使外植体多毛多刺部位形成的顽固气泡破裂，气体逸出，彻底清除藏菌死角，保证消毒杀菌液浸润到外植体所有的表面，快速、安全、高效获得多毛多刺外植体无菌材料。【IPC分类】A01H4-00【公开号】CN104542279【申请号】CN201410817763【专利技术人】许鸿源, 周凤珏, 龚银花, 梁琼月, 许皓翔, 莫淑媚 【申请人】广西大学【公开日】2015年4月29日【申请日】2014年12月24日本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种多刺多毛植物外植体的消毒灭菌方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将外植体按常规流水冲洗表面灰尘，除去游离水，按常规对外植体进行表面消毒；(2)将外植体浸泡到用容器装盛的含表面活性剂的消毒杀菌液中，消毒杀菌液的液面高出外植体1cm以上；(3)将容器放入连接有抽气泵的真空干燥器中，启动抽气泵，抽气时间为2‑10分钟，至没有气体逸出消毒杀菌液的液面时停止抽气，将外植体取出，用无菌水按常规反复洗涤外植体至无皂泡发生，即获得多刺多毛植物外植体的无菌材料。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：许鸿源，周凤珏，龚银花，梁琼月，许皓翔，莫淑媚，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：广西;45
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