一种无血清的诱导多功能干细胞冻存液及冻存方法技术

本发明专利技术提供了一种诱导多功能干细胞冻存液及其冻存方法，其中冻存液由DMEM基础培养基、NEAA、KSR、DMSO和羟乙基淀粉等组成，冻存液成分明确，无动物血清污染，极具应用价值。冻存方法操作简便，不需要反复冻融和现配现用。采用本发明专利技术的冻存液及冻存方法冻存的细胞具有细胞活力好，增殖速度快等优点。对促进诱导多功能干细胞研究、建立诱导多功能干细胞库具有重大意义。

A serum-free induction multifunction stem cell cryopreservation solution and cryopreservation method

The invention provides an induction multifunctional stem cell cryopreservation solution and a cryopreservation method thereof, in which the cryopreservation solution is composed of DMEM basic medium, NEAA, KSR, DMSO and hydroxyethyl starch, etc. The composition of the cryopreservation solution is clear, and there is no animal serum pollution, and the cryopreservation solution has great application value. The freezing method is easy to operate and does not require repeated freezing and thawing. The cells frozen by the cryopreservation solution and the cryopreservation method of the invention have the advantages of good cell vitality and fast proliferation speed. It is of great significance to promote the induction of pluripotent stem cells and the establishment of induced pluripotent stem cell bank.

【技术实现步骤摘要】
一种无血清的诱导多功能干细胞冻存液及冻存方法
本专利技术涉及干细胞生物学与再生医学领域，具体地涉及一种诱导多功能干细胞冻存液以及诱导多功能干细胞冻存方法。
技术介绍
诱导的多能干细胞是指将分化的体细胞重编程而获得的多潜能干细胞，具有自我更新及多向分化的潜能，它在干细胞蛋白标记基因和蛋白表达水平、畸胎瘤形成、自我更新潜能和多向分化能力等许多方面类似于胚胎干细胞。诱导多功能干细胞不受细胞来源、免疫排斥、伦理、宗教和法律等诸多方面的限制，在药物开发、疾病治疗和机理研究方面极具应用价值，是当前全球干细胞研究的热点。由于多功能干细胞的获得是时间和劳动密集型，而且干细胞的细胞表型会受到传代次数的影响，故在研究过程中经常会涉及到干细胞的冻存。在冻存过程中会显著改变多功能干细胞的热力学、化学和物理环境，对细胞造成损伤，冻存不当甚至会导致细胞死亡。冻存过程中的影响因素有：细胞浓度、冷冻速率和冻存液。以较高的细胞浓度进行冻存，细胞的存活率更高，冻存速率是以1℃/min的速率进行冻存效果最佳。目前最常用的干细胞冻存液为90％胎牛血清(FBS)+10％二甲基亚砜(DMSO)，或者50％干细胞完全培养基+40％FBS+10％DMSO。DMSO虽然对细胞的穿透力较强，可以降低细胞的冰点，减少冰晶的形成，在降温的过程中能对细胞达到保护作用。但是高浓度二甲基亚砜具有毒性，可以与细胞内蛋白质的疏水基团发生作用，导致蛋白质变性，造成细胞损伤或者失活。而且现有的冻存液由于使用动物源的血清导致细胞冻存液中参入非人员物质，会对多功能干细胞造成残留或者污染。为获得无动物源污染、数量大的诱导多功能干细胞，并建立多功能干细胞库，研究开发出一种无动物外源成分、对细胞损伤较小并能够长久保存多功能干细胞的冻存液及冻存方法，对诱导多功能干细胞的研究具有重要意义。
技术实现思路
为有助于理解本专利技术，下面定义了一些术语。本文定义的术语具有本专利
的普通技术人员通常理解的含义。除非另外说明，本文中的iPSCs为诱导多功能干细胞的英文简称，DMSO为二甲基亚砜的英文简称，KSR为血清替代品的英文简称，DMEM为基础培养基的英文简称。除非另外说明，本文中的多功能干细胞和细胞均指诱导多功能干细胞。本专利技术要解决的技术问题是提供一种操作简便、无动物外源成分、细胞存活率更高的诱导多功能干细胞冻存液及冻存方法。本专利技术的一个目的是提供一种诱导多功能干细胞的冻存液。本专利技术所述的冻存液由A液和B液组成。A液与B液的体积比为1:1。所述的A液100mL中含有0-3％β-巯基乙醇、0-5％白血病抑制因子、0-4％的NEAA、0-4％的L-谷氨酰胺、0-5μMCHIR99021、0-5μMPD0325901、38-55％的KSR和40-58％的DMEM。优选地，所述的A液100mL中含有0.5-2％β-巯基乙醇、0.5-2％白血病抑制因子、0.3-3％的NEAA、0.3-3％的L-谷氨酰胺、1-4μMCHIR99021、1-4μMPD0325901、40-50％的KSR和45-55％的DMEM。更优选地，所述的A液100mL中含有0.8％β-巯基乙醇、0.8％白血病抑制因子、1％的NEAA、1％的L-谷氨酰胺、2μMCHIR99021、1μMPD0325901、45％的KSR和51.4％的DMEM。所述的B液100mL中含有6-12％KSR、0-3.5％的NEAA、0-3.5％的L-谷氨酰胺、0.5-1.5％β-巯基乙醇、1-2％白血病抑制因子、2-5μMCHIR99021、0.1-1μMPD0325901、7-15％的DMSO、6-15％的羟乙基淀粉和55-68％的DMEM。优选地，所述的B液100mL中含有8-11％KSR、1-3％的NEAA、1-3％的L-谷氨酰胺、0.8-1.2％β-巯基乙醇、1.5-1.8％白血病抑制因子、2.5-3μMCHIR99021、0.5-0.8μMPD0325901、8-13％的DMSO、8-13％的羟乙基淀粉和60-65％的DMEM。更优选地，所述的B液100mL中含有10％KSR、2％的NEAA、2％的L-谷氨酰胺、1％β-巯基乙醇、1.6％白血病抑制因子、3μMCHIR99021、0.6μMPD0325901、10％的DMSO、10％的羟乙基淀粉和63.4％的DMEM。本专利技术另一个目的是提供一种诱导多功能干细胞的冻存方法，该方法包括以下步骤：a.将消化的多功能干细胞离心后后加入适量A液。b.加入等量B液混匀。c.将干细胞与冻存液的混合液放于程序降温盒中冷冻，24小时后将冷冻的细胞悬液转移到液氮中。优选地，所述的细胞悬液终浓度为1×106-6×106个/mL。本专利技术的冻存液成分明确，不含有动物血清，避免了动物源性污染。KSR代替了动物血清，无动物外源性成分，整个配方组成清晰，更加安全，对于多功能干细胞的进一步研究不会造成干扰。KSR中的β-巯基乙醇和成纤维细胞生长因子，以及B液中的DMSO和羟乙基淀粉在冻存的过程中可以增加细胞的通透性，并且可以在冻存过程中保护细胞，降低细胞的冰点，减少冰晶的产生，从而保持细胞活力，防止多功能干细胞出现分化。与现有的技术方案相比，本专利技术的有益效果：第一，本专利技术的冻存液不含有动物血清，对干细胞无外源性动物成分污染。第二，本专利技术减少了DMSO的用量，降低了冻存液中高浓度DMSO对细胞的损伤，从而保持细胞活性，有效防止细胞分化。第三，本专利技术的冻存液可于4℃保存，不需要反复冻融和现配现用。第四，本专利技术的冻存方法操作简便，节约人力。附图说明为了清晰地阐明本专利技术的具体实施方式，提供了以下附图，用以描述本专利技术的一些实施方式。图1显示多功能干细胞复苏1天后的细胞形态图。图2显示本专利技术所述冻存液及冻存方法冻存的细胞以及常规的冻存液冻存的细胞复苏后克隆的生长情况。图3显示本专利技术所述冻存液及冻存方法冻存的细胞以及常规的冻存液冻存的细胞复苏后测定的生长曲线。图4显示多功能干细胞复苏以后碱性磷酸酶检测图。图5表示多功能干细胞免疫荧光鉴定图。具体实施方式为更好的说明本专利技术的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、诱导多功能干细胞冻存液的配制冻存液由A液和B液组成。A液与B液的体积比为1:1。每100mL冻存液A液中含有以下组分：每100mL冻存液B液中含有以下组分：配制方法:将各成分混匀后分别得到A液和B液，4℃保存。实施例2、冻存液在冻存诱导多功能干细胞中的应用冻存方法：将处于对数生长期的诱导多功能干细胞消化后，800rpm/min离心5分钟后去上清，用适量本专利技术的A液进行重悬，进行细胞计数后，加入等量的B液，使细胞浓度为1×106-6×106个/mL，然后1mL/管的量分装于1.8mL的细胞冻存管中，放于程序降温盒内置于-80℃进行程序降温，24小时后转入液氮中进行保存。冻存结果检验：1、多功能干细胞复苏后形态观察冻存后的细胞复苏后每天换液，在显微镜下进行形态观察，待形成克隆后拍照。复苏后的多功能干细胞形态如图1所示，可见多功能干细胞克隆呈圆形，边缘清晰，克隆边缘无分化的细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种无血清的诱导多功能干细胞冻存液，其特征在于，所述冻存液由A液和B液组成。

【技术特征摘要】
1.一种无血清的诱导多功能干细胞冻存液，其特征在于，所述冻存液由A液和B液组成。2.根据权利要求1所述的无血清的诱导多功能干细胞冻存液，其特征在于，所述A液100mL中含有0-3％β-巯基乙醇、0-5％白血病抑制因子、0-4％的NEAA、0-4％的L-谷氨酰胺、0-5μMCHIR99021、0-5μMPD0325901、38-55％的KSR和40-58％的DMEM；所述B液100mL中含有6-12％KSR、0-3.5％的NEAA、0-3.5％的L-谷氨酰胺、0.5-1.5％β-巯基乙醇、1-2％白血病抑制因子、2-5μMCHIR99021、0.1-1μMPD0325901、7-15％的DMSO、6-15％的羟乙基淀粉和55-68％的DMEM。3.根据权利要求1或2所述的无血清的诱导多功能干细胞冻存液，其特征在于，所述A液100mL中含有0.5-2％β-巯基乙醇、0.5-2％白血病抑制因子、0.3-3％的NEAA、0.3-3％的L-谷氨酰胺、1-4μMCHIR99021、1-4μMPD0325901、40-50％的KSR和45-55％的DMEM；所述B液100mL中含有8-11％KSR、1-3％的NEAA、1-3％的L-谷氨酰胺、0.8-1.2％β-巯基乙醇、1.5-1.8％白血病抑制因子、2.5-...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘樱，彭特，陈勇，蔡亚雄，于云飞，乔志平，
申请(专利权)人：广东艾时代生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：广东,44