本发明专利技术公开了一种降低‑80℃冻存对CIK细胞杀伤肿瘤活性的方法。本发明专利技术发现蔓荆子二萜C、D、E或山藿香定可以通过抑制CIK细胞中hsa‑miR‑543的表达水平提高其在‑80℃冻存6月后对肿瘤细胞的杀伤力，冻存前经蔓荆子二萜C、D、E或山藿香定预处理可以将其于‑80℃冻存6月后对肿瘤细胞的杀伤力维持在冻存前的水平。因此，本发明专利技术提供的方法可以有效降低‑80℃冻存对CIK细胞杀伤肿瘤活性的不利影响。
A method to reduce tumor killing activity of -80 CIK cryopreserved cells
The invention discloses a method for reducing tumor killing activity of CIK cells by freezing at 80 degrees centigrade. It was found that Vitex diterpenoids C, D, E, or geranidin could increase the cytotoxicity of HSa_Mi_543 to tumor cells by inhibiting the expression of hsa_Mi_543 in CIK cells. Vitex diterpenoids C, D, E or geranidin pretreatment before cryopreservation could kill tumor cells at 80 for 6 months. The force remained at the level before freezing. Therefore, the method provided by the invention can effectively reduce the adverse effect of cryopreservation at 80 on the killing activity of CIK cells against tumor.
【技术实现步骤摘要】
一种降低-80℃冻存对CIK细胞杀伤肿瘤活性的方法
本专利技术属于细胞免疫领域，涉及一种降低-80℃冻存对CIK细胞杀伤肿瘤活性的方法。
技术介绍
-80℃冻存常用于对CIK细胞进行6个月内的短期保存。研究表明，-80℃冻存3个月可以基本保持CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，但是从第4个月开始，复苏后的CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤力显著降低(参考文献：不同冻存时间对CIK细胞免疫表型及杀伤活性的影响，现代肿瘤医学，2016年05月第24卷第10期)。上述缺陷影响了-80℃冻存对CIK细胞6个月短期保存的效果。
技术实现思路
本专利技术旨在克服现有技术不足，提供降低-80℃冻存对CIK细胞杀伤肿瘤活性的方法。本专利技术技术方案如下：一种降低-80℃冻存对CIK细胞杀伤肿瘤活性的方法，冻存前先用hsa-miR-543抑制剂预处理，所述hsa-miR-543抑制剂为蔓荆子二萜C。一种-80℃冻存CIK细胞的方法：取培养中的CIK细胞，于冻存前一定时间在培养基中添加有效浓度的hsa-miR-543抑制剂蔓荆子二萜C，培养一定时间后，离心弃上清液，加入冻存液，调整细胞浓度至合适浓度，梯度降温至-80℃冻存。优选地，于冻存前8h在培养基中添加有效浓度的hsa-miR-543抑制剂蔓荆子二萜C，培养8h后，离心弃上清液。优选地，蔓荆子二萜C浓度为10μM。优选地，冻存液由RPMI1640培养基、自体血浆和二甲基亚砜按体积比5:4:1混合而成。优选地，调整细胞浓度至2×107/ml。优选地，梯度降温方法为：首先于4℃冰箱中放置1h，然后-20℃冰箱中放置2h，转至-80℃低温冰箱放置。一种降低-80℃冻存对CIK细胞杀伤肿瘤活性的方法，冻存前先用hsa-miR-543抑制剂预处理，所述hsa-miR-543抑制剂为蔓荆子二萜D或蔓荆子二萜E。一种-80℃冻存CIK细胞的方法：取培养中的CIK细胞，于冻存前一定时间在培养基中添加有效浓度的hsa-miR-543抑制剂蔓荆子二萜D或蔓荆子二萜E，培养一定时间后，离心弃上清液，加入冻存液，调整细胞浓度至合适浓度，梯度降温至-80℃冻存。优选地，于冻存前8h在培养基中添加有效浓度的hsa-miR-543抑制剂蔓荆子二萜D或蔓荆子二萜E，培养8h后，离心弃上清液。优选地，蔓荆子二萜D或蔓荆子二萜E浓度为10μM。优选地，冻存液由RPMI1640培养基、自体血浆和二甲基亚砜按体积比5:4:1混合而成。优选地，调整细胞浓度至2×107/ml。优选地，梯度降温方法为：首先于4℃冰箱中放置1h，然后-20℃冰箱中放置2h，转至-80℃低温冰箱放置。一种降低-80℃冻存对CIK细胞杀伤肿瘤活性的方法，冻存前先用hsa-miR-543抑制剂预处理，所述hsa-miR-543抑制剂为山藿香定。一种-80℃冻存CIK细胞的方法：取培养中的CIK细胞，于冻存前一定时间在培养基中添加有效浓度的hsa-miR-543抑制剂山藿香定，培养一定时间后，离心弃上清液，加入冻存液，调整细胞浓度至合适浓度，梯度降温至-80℃冻存。优选地，于冻存前8h在培养基中添加有效浓度的hsa-miR-543抑制剂山藿香定，培养8h后，离心弃上清液。优选地，山藿香定浓度为10μM。优选地，冻存液由RPMI1640培养基、自体血浆和二甲基亚砜按体积比5:4:1混合而成。优选地，调整细胞浓度至2×107/ml。优选地，梯度降温方法为：首先于4℃冰箱中放置1h，然后-20℃冰箱中放置2h，转至-80℃低温冰箱放置。有益效果：本专利技术发现蔓荆子二萜C、D、E或山藿香定可以通过抑制CIK细胞中hsa-miR-543的表达水平提高其在-80℃冻存6月后对肿瘤细胞的杀伤力，冻存前经蔓荆子二萜C、D、E或山藿香定预处理可以将其于-80℃冻存6月后对肿瘤细胞的杀伤力维持在冻存前的水平。因此，本专利技术提供的方法可以有效降低-80℃冻存对CIK细胞杀伤肿瘤活性的不利影响。附图说明图1为药物干预对CIK细胞中hsa-miR-543表达及冻存前后肿瘤杀伤力的影响。具体实施方式下面结合附图和实施例具体介绍本专利技术实质性内容，但并不以此限定本专利技术的保护范围。一、实验材料蔓荆子二萜B、C、D、E、山藿香定和12-表山藿香定购买或自制，纯度均在95％以上。化学结构及CAS登录号信息如下表所示。RPMI1640培养基购自Gibco公司。PrimeScripRTMasterMix(反转录试剂盒)、SYBRPremixExTaq(荧光定量PCR试剂盒)均购自大连宝生物公司。二、实验方法1、CIK细胞分离、体外扩增、冻存与复苏CIK细胞的分离：采集健康志愿者外周抗凝全血，按等体积沿管壁缓慢加入到有20ml淋巴细胞分离液(Ficoll液)的50ml离心管中，1800r/min，4℃离心20min，抽取白膜细胞层，PBS洗涤3遍得到外周血单个核细胞(PBMC)。同时吸取上层自体血浆，56℃灭活30min，室温下2000g离心10min，4℃保存备用。CIK细胞的体外扩增：将PBMC悬浮于含10％灭活的自体血浆的RPMI1640培养基，调整细胞密度1.5×106/ml，并加入IFN-γ(1000IU/ml)，细胞置37℃、5％CO2培养箱中培养，24h后加入抗CD3McAb(50ng/ml)、rhIL-2(500IU/ml)和rhIL-1α(300IU/ml)。之后每隔2天添加含有5％自体血浆、1000IU/mlrhIL-2的RPMI1640培养基，每次补液后将细胞密度控制为1.5×106/ml。培养15天后进行冻存。CIK细胞的冻存：取CIK细胞，1000r/min离心10min，弃上清液，加入冻存液(RPMI1640培养基、自体血浆和二甲基亚砜体积比5:4:1)，调整细胞浓度至2×107/ml，首先于4℃冰箱中放置1h，然后-20℃冰箱中放置2h，转至-80℃低温冰箱放置6个月。CIK细胞的复苏：从-80℃冰箱中取出冻存的CIK细胞，迅速放入37℃水浴锅内融化，用RPMI1640培养基洗涤，按1.5×106/ml的细胞密度悬浮于含1000IU/mlrhIL-2、5％自体血浆的RPMI1640培养基，37℃、5％CO2培养箱中培养。2、分组和给药实验分组包括未冻存组、冻存6月组，具体处理方法如下：未冻存组：培养15天收集的未冻存CIK细胞；冻存6月组：培养15天后冻存6个月的CIK细胞；冻存前，CIK细胞经0或10μM药物(蔓荆子二萜B、C、D、E、山藿香定或12-表山藿香定)干预8小时。3、CCK-8法检测冻存后CIK细胞杀伤活性选对数生长期的K562细胞作为靶细胞，调整细胞密度均为1×105/ml；取未冻存组和冻存6月组复苏的CIK作为效应细胞，1500r/min，离心5min，弃上清，并用RPMI1640培养液洗涤，调整CIK细胞密度为2×106/ml(效靶比为20:1)。该实验分为实验组、效应细胞组、靶细胞组，每组设3个复孔，实验组于96孔板每孔加效应细胞、靶细胞各100μl；靶细胞组每孔加入靶细胞、RPMI1640培养液各100μl；效应细胞组每孔加入效应细胞、RPMI1640培养液各100μl，置37℃、5％CO2培养箱中培养24h后，每孔加入CCK8溶液20μl，3本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种降低‑80℃冻存对CIK细胞杀伤肿瘤活性的方法，冻存前先用hsa‑miR‑543抑制剂预处理，所述hsa‑miR‑543抑制剂为蔓荆子二萜D或蔓荆子二萜E。
【技术特征摘要】
1.一种降低-80℃冻存对CIK细胞杀伤肿瘤活性的方法，冻存前先用hsa-miR-543抑制剂预处理，所述hsa-miR-543抑制剂为蔓荆子二萜D或蔓荆子二萜E。2.一种-80℃冻存CIK细胞的方法，其特征在于：取培养中的CIK细胞，于冻存前一定时间在培养基中添加有效浓度的hsa-miR-543抑制剂蔓荆子二萜D或蔓荆子二萜E，培养一定时间后，离心弃上清液，加入冻存液，调整细胞浓度至合适浓度，梯度降温至-80℃冻存。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：于冻存前8h在培养基中添加有效浓度的h...
【专利技术属性】
技术研发人员：沈兵，
申请(专利权)人：沈兵，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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