脐带间充质干细胞培养上清的低温冷藏保存方法技术

脐带间充质干细胞培养上清的低温冷藏保存方法，属于脐带间充质干细胞保存技术领域。取足月健康新生儿脐带，经过检查鉴定可用，然后进行分离、培养、饥饿培养，制备干细胞培养上清，最后加入白花檵木提取物保护液于0‑8℃条件下低温冷藏，本发明专利技术的保护方法确保脐带间充质干细胞培养上清在低温(0‑8℃)条件下保存15天，干细胞上清中的总蛋白质含量基本不变，且EGF、VEGF和TNF‑α含量均没有明显改变，延长干细胞上清液在低温条件下的存放时间，降低保存和运输成本。

Cryopreservation method for culture supernatants of umbilical cord mesenchymal stem cells

The method for cryopreservation of umbilical cord mesenchymal stem cell culture supernatant belongs to the technical field of umbilical cord mesenchymal stem cell preservation. The umbilical cord of full-term healthy newborns is examined and identified to be usable, and then the supernatant of stem cell culture is prepared by isolation, culture and starvation culture. Finally, the supernatant of umbilical cord mesenchymal stem cell culture is added to the protective liquid of Sassafras Alba extract and refrigerated at 0_8 C. The protective method of the invention ensures that the supernatant of umbilical cord mesenchymal stem cell culture is kept at low temperature (0 The total protein content of stem cell supernatant remained unchanged after 15 days of storage, and the contents of EGF, VEGF and TNF_alpha remained unchanged.

【技术实现步骤摘要】
脐带间充质干细胞培养上清的低温冷藏保存方法
本专利技术属于生物
涉及一种脐带间充质干细胞培养上清冷藏保存方法，属于脐带间充质干细胞保存

技术介绍
间充质干细胞(MSCs)最早发现于1968年是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞，MSC最初在骨髓中发现，因其具有易于采集和分离、免疫原性低、分化及旁分泌能力强、造血支持等特点而日益受到人们的关注。间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复脐带间充质干细胞是从人脐带组织中的沃顿胶分离培养获得的一种来源的间充质干细胞，流式细胞仪检测结果显示，贴壁细胞均表达CD44、CD29，低表达CD106，不表达造血细胞表型CD14、CD34、CD45和内皮细胞表型CD31，也不表达HLA-DR，具有和骨髓、胎盘羊膜以及脂肪组织来源的间充质干细胞一样的表面抗原。脐带间充质干细胞(MSCs)具有多向分化潜能，可向多个方向进行分化。它在骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、内皮和心肌等组织工程方面具有广阔的临床应用前景。研究报道从人脐带中分离出MSCs，无论细胞含量、增殖能力还是分化能力均优于骨髓MSCs，免疫原性比骨髓MSCs低，并且具有取材方便，无伦理学争议等优点，因此越来越受到研究工作者们的关注。干细胞的培养体系主要采用含动物血清(如胎牛血清)或无血清的培养基(无血清便于临床研究)，对脐带沃顿胶组织进行贴壁扩增培养间充质干细胞，同时研究脐带间充质干细胞形态学、生长特性、免疫表型等特性(详见图1和2)，旨在建立脐带间充质干细胞的富集方法，为建立脐带间充质干细胞库和临床应用提供有力的理论依据。
技术实现思路
本专利技术目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种脐带间充质干细胞培养上清低温(0-8℃)的保存方法，延长其保存时间。本专利技术采取的方案是：一种脐带间充质干细胞培养上清低温(0-8℃)保存方法步骤如下：(1)取足月健康胎儿脐带，用荧光定量PCR相结合的方法检测脐带血清HbsAg，抗-HCV,抗-HDV,抗-HEV,抗-HIV-1/2,HCV-RNA,HIV-1-RNA,CMV-DNA,检测结果均为阴性可用(2)将手术室取出的脐带放入装有生理盐水的无菌培养瓶中，4℃保存或运输至无菌实验室；入细胞培养室后，去除细胞培养瓶瓶口处的封口塑料，后放入处于运行状态的洁净台中。(3)从4℃的冰箱中取出DMEM培养基，FBS,使其慢慢恢复至室温。(4)脐带华通氏胶的剥离并洗涤优选:在生理盐水中洗涤去除脐带血渍，然后浸泡酒精消毒，再次用生理盐水洗涤，在装有生理盐水的培养皿中将将脐带剪成2-3cm小段，并用生理盐水洗涤清除脐带小段血管中的淤血和凝块；然后剥离华通氏胶，用生理盐水进行洗涤；(5)组织块制备剪切脐带华通氏胶：将步骤(4)洗涤后的脐带华通氏胶剪切成1-5mm的组织匀浆；用生理盐水洗涤组织匀浆，进行离心；(6)接种将步骤(5)离心后的组织匀浆去除上清后，接种到接种培养瓶如T150中，并平铺到整个接种培养瓶底面；(7)脐带华通氏胶的培养平置步骤(6)接种培养瓶，放置于CO2培养箱中，6-12个小时后将培养瓶缓慢直立起来，往培养瓶中底部加入含有5％-10％胎牛血清的基础培养基(DMEM培养基)，然后缓慢让它浸润整个组织块；培养条件：37.0±0.5℃，CO2浓度为5.0±0.2％；(8)换液第一次换液：步骤(7)脐带华通氏胶培养到第5天进行全量换液；将旧的培养基和未贴壁的组织块倒掉，加入等量的含有5％-10％胎牛血清的培养基，平置培养瓶，放置到从CO2培养箱中继续培养；第二次换液：脐带华通氏胶培养到10天后，重复第一次换液的操作；(9)收获原代细胞细胞观察：脐带华通氏胶培养到,14-16天后，将所有培养瓶在显微镜下观察，如观察到细胞融合度达到70％-80％时，即可进行消化收获；(10)原代细胞收获配置细胞消化液：按照体积比1:4的比例混合胰酶与生理盐水，混合液即为细胞消化液。去除旧的培养液：摇晃培养瓶并用移液器吹打，使未贴壁组织块脱落，再将组织块和旧的培养液一起倒入废液瓶中；洗涤：往每个去掉旧培养液的瓶中倒入生理盐水，轻轻摇晃培养瓶，使生理盐水液体浸润培养瓶底面和组织块，再将生理盐水倒掉，重复洗涤一次；消化：往洗涤后的每个培养瓶中加入消化液，使每个培养瓶的消化液浸润整个培养瓶底面，静置1min，上下摇晃培养瓶，使消化液充分接触细胞，镜下观察90％的细胞脱落变圆后可停止消化；终止消化：往可终止消化的培养瓶中每瓶加入含有胎牛血清的DMEM培养基，进行终止消化，前后摇晃培养瓶，进行充分接触稀释，然后转移到离心管中离心；(10)原代细胞传代(P0传P1)将上一步离心完后的细胞，去掉上清后加入含有胎牛血清的DMEM培养基，将细胞沉淀重悬均匀并合并到一个离心管里面，细胞计数板计数；将重悬后的细胞悬液接种到培养瓶并用含有胎牛血清的DMEM培养基定容到一定体积，使细胞达到一定浓度；摇匀放入CO2培养箱培养，培养条件：37±0.5℃、5.0±0.2％的CO2浓度，培养至细胞融合度达到80-90％。优选种瓶：50000cells/cm2接种于T150的培养瓶中。(11)干细胞培养上清根据步骤(9)-(10)，细胞传代至第四代P4(步骤(10)，养至细胞融合度达到80-90％)。除去培养瓶中的培养基，并用生理盐水缓冲液清洗2-3次，然后吸尽培养瓶中生理盐水液，加入DMEM培养基，饥饿培养48小时；(12)保存吸出收集培养瓶中饥饿培养48小时后的干细胞培养上清，进行离心，弃沉淀，收集干细胞培养上清，用5KD透析袋进行浓缩，浓缩，获取分子量在5000以上的干细胞分泌因子；在上述浓缩后的干细胞培养上清中加入质量百分比浓度0.5-5％(优选1％)的白花檵木提取物的DMEM培养基作为干细胞培养上清的保护剂，放入0-8℃的冰箱保存。优选加入保护剂后，细胞的浓度为1x104-1x106个/ml。本专利技术的保护方法确保脐带间充质干细胞培养上清在低温(0-8℃)条件下保存15天，干细胞上清中的总蛋白质含量基本不变，且EGF、VEGF和TNF-α含量均没有明显改变，延长干细胞上清液在低温条件下的存放时间，降低保存和运输成本。附图说明图1、不同阶段和时期间充质干细胞镜下形态特点(40倍)：脐带间充质干细胞呈纺锤形生长。图2、流式细胞仪鉴定脐带间充质干细胞免疫表型表征流式细胞术检测结果表明，表面抗原CD105,CD73和CD44阳性率大于96％,而CD34,CD45,CD31,CD146和HLA-DR不足1％，保证了脐带间充质干细胞的纯度。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步说明，但本专利技术并不限于以下实施例。白花檵木提取物的制备：将白花檵木鲜材料破碎，采用水煮、水提醇沉或乙醇提取，溶剂为水或50-90％的乙醇；回流前浸渍20-50min，回流提取时间为50-80min，回流次数为1-2次，醇沉浓度为50-80％的乙醇；最后减压干燥得白花檵木提取物。实施例1一种脐带间充质干细胞培养上清低温(0-8℃)保存方法步骤如本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种脐带间充质干细胞培养上清低温保存方法，其特征在于，步骤如下：(1)取足月健康胎儿脐带，用荧光定量PCR相结合的方法检测脐带血清HbsAg，抗‑HCV,抗‑HDV,抗‑HEV,抗‑HIV‑1/2,HCV‑RNA,HIV‑1‑RNA,CMV‑DNA,检测结果均为阴性可用(2)将手术室取出的脐带放入装有生理盐水的无菌培养瓶中，4℃保存或运输至无菌实验室；入细胞培养室后，去除细胞培养瓶瓶口处的封口塑料，后放入处于运行状态的洁净台中；(3)从4℃的冰箱中取出DMEM培养基，FBS,使其慢慢恢复至室温；(4)脐带华通氏胶的剥离并洗涤；(5)组织块制备剪切脐带华通氏胶：将步骤(4)洗涤后的脐带华通氏胶剪切成1‑5mm的组织匀浆；用生理盐水洗涤组织匀浆，进行离心；(6)接种将步骤(5)离心后的组织匀浆去除上清后，接种到接种培养瓶如T150中，并平铺到整个接种培养瓶底面；(7)脐带华通氏胶的培养平置步骤(6)接种培养瓶，放置于CO2培养箱中，6‑12个小时后将培养瓶缓慢直立起来，往培养瓶中底部加入含有5％‑10％胎牛血清的基础培养基(DMEM培养基)，然后缓慢让它浸润整个组织块；培养条件：37.0±0.5℃，CO2浓度为5.0±0.2％；(8)换液第一次换液：步骤(7)脐带华通氏胶培养到第5天进行全量换液；将旧的培养基和未贴壁的组织块倒掉，加入等量的含有5％‑10％胎牛血清的培养基，平置培养瓶，放置到从CO2培养箱中继续培养；第二次换液：脐带华通氏胶培养到10天后，重复第一次换液的操作；(9)收获原代细胞细胞观察：脐带华通氏胶培养到,14‑16天后，将所有培养瓶在显微镜下观察，如观察到细胞融合度达到70％‑80％时，即可进行消化收获；(10)原代细胞收获配置细胞消化液：按照体积比1:4的比例混合胰酶与生理盐水，混合液即为细胞消化液；去除旧的培养液：摇晃培养瓶并用移液器吹打，使未贴壁组织块脱落，再将组织块和旧的培养液一起倒入废液瓶中；洗涤：往每个去掉旧培养液的瓶中倒入生理盐水，轻轻摇晃培养瓶，使生理盐水液体浸润培养瓶底面和组织块，再将生理盐水倒掉，重复洗涤一次；消化：往洗涤后的每个培养瓶中加入消化液，使每个培养瓶的消化液浸润整个培养瓶底面，静置1min，上下摇晃培养瓶，使消化液充分接触细胞，镜下观察90％的细胞脱落变圆后可停止消化；终止消化：往可终止消化的培养瓶中每瓶加入含有胎牛血清的DMEM培养基，进行终止消化，前后摇晃培养瓶，进行充分接触稀释，然后转移到离心管中离心；(10)原代细胞传代(P0传P1)将上一步离心完后的细胞，去掉上清后加入含有胎牛血清的DMEM培养基，将细胞沉淀重悬均匀并合并到一个离心管里面，细胞计数板计数；将重悬后的细胞悬液接种到培养瓶并用含有胎牛血清的DMEM培养基定容到一定体积，使细胞达到一定浓度；摇匀放入CO2培养箱培养，培养条件：37±0.5℃、5.0±0.2％的CO2浓度，培养至细胞融合度达到80‑90％；(11)干细胞培养上清根据步骤(9)‑(10)，细胞传代至第四代P4；除去培养瓶中的培养基，并用生理盐水缓冲液清洗2‑3次，然后吸尽培养瓶中生理盐水液，加入DMEM培养基，饥饿培养48小时；(12)保存吸出收集培养瓶中饥饿培养48小时后的干细胞培养上清，进行离心，弃沉淀，收集干细胞培养上清，用5KD透析袋进行浓缩，浓缩，获取分子量在5000以上的干细胞分泌因子；在上述浓缩后的干细胞培养上清中加入质量百分比浓度0.5‑5％的白花檵木提取物的DMEM培养基作为干细胞培养上清的保护剂，放入0‑8℃的冰箱保存。...

【技术特征摘要】
1.一种脐带间充质干细胞培养上清低温保存方法，其特征在于，步骤如下：(1)取足月健康胎儿脐带，用荧光定量PCR相结合的方法检测脐带血清HbsAg，抗-HCV,抗-HDV,抗-HEV,抗-HIV-1/2,HCV-RNA,HIV-1-RNA,CMV-DNA,检测结果均为阴性可用(2)将手术室取出的脐带放入装有生理盐水的无菌培养瓶中，4℃保存或运输至无菌实验室；入细胞培养室后，去除细胞培养瓶瓶口处的封口塑料，后放入处于运行状态的洁净台中；(3)从4℃的冰箱中取出DMEM培养基，FBS,使其慢慢恢复至室温；(4)脐带华通氏胶的剥离并洗涤；(5)组织块制备剪切脐带华通氏胶：将步骤(4)洗涤后的脐带华通氏胶剪切成1-5mm的组织匀浆；用生理盐水洗涤组织匀浆，进行离心；(6)接种将步骤(5)离心后的组织匀浆去除上清后，接种到接种培养瓶如T150中，并平铺到整个接种培养瓶底面；(7)脐带华通氏胶的培养平置步骤(6)接种培养瓶，放置于CO2培养箱中，6-12个小时后将培养瓶缓慢直立起来，往培养瓶中底部加入含有5％-10％胎牛血清的基础培养基(DMEM培养基)，然后缓慢让它浸润整个组织块；培养条件：37.0±0.5℃，CO2浓度为5.0±0.2％；(8)换液第一次换液：步骤(7)脐带华通氏胶培养到第5天进行全量换液；将旧的培养基和未贴壁的组织块倒掉，加入等量的含有5％-10％胎牛血清的培养基，平置培养瓶，放置到从CO2培养箱中继续培养；第二次换液：脐带华通氏胶培养到10天后，重复第一次换液的操作；(9)收获原代细胞细胞观察：脐带华通氏胶培养到,14-16天后，将所有培养瓶在显微镜下观察，如观察到细胞融合度达到70％-80％时，即可进行消化收获；(10)原代细胞收获配置细胞消化液：按照体积比1:4的比例混合胰酶与生理盐水，混合液即为细胞消化液；去除旧的培养液：摇晃培养瓶并用移液器吹打，使未贴壁组织块脱落，再将组织块和旧的培养液一起倒入废液瓶中；洗涤：往每个去掉旧培养液的瓶中倒入生理盐水，轻轻摇晃培养瓶，使生理盐水液体浸润培养瓶底面和组织块，再将生理盐水倒掉，重复洗涤一次；消化：往洗涤后的每个培养瓶中加入消化液，使每个培养瓶的消化液浸润整个培养瓶底面，静置1min，上下摇晃培养瓶，使消化液充分接触细胞，镜下观察90％的细胞脱落变圆后可停止消化；终止消化：往可终止消化的培养瓶中每瓶加入含有胎牛血清的DMEM培养基，进行终止消化，前后摇晃培...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘学彬，
申请(专利权)人：北京中广天一生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11