一种增强人间充质干细胞生物学特性的诱导处理方法技术

本发明专利技术公开了一种增强人间充质干细胞生物学特性的诱导处理方法，属于间充质干细胞的诱导技术领域。诱导培养基在普通间充质干细胞培养基的基础上加入了不同浓度的白花檵木作为诱导物。间充质干细胞来源包括骨髓、脐带、胎盘、牙髓、脐带血等一切富含间充质干细胞的人体组织。这种诱导处理方法是采用不同浓度的白花檵木提取物对经传代培养稳定的人间充质干细胞进行共培养48小时。本发明专利技术能够有效提升间充质干细胞的包括抗氧化、抗凋亡、抗衰老、血管再生以及组织修复等各种生物学特性。

【技术实现步骤摘要】
一种增强人间充质干细胞生物学特性的诱导处理方法
本专利技术属于生物
的一种间充质干细胞的诱导处理方法，具体涉及的是一种诱导后增强间充质干细胞多种生物学特性的方法。
技术介绍
间充质干细胞是一类存在于多种组织(如骨髓、脐带血和脐带组织、胎盘组织、脂肪组织等)，具有自我复制和多向分化潜力，非造血系的成体干细胞。这类干细胞具有向多种间充质系列细胞(如成骨、成软骨及脂肪细胞等)分化或跨系分化成非间充质系列细胞的潜能(比如心脏细胞、神经细胞)，并具有独特的细胞因子分泌功能以及免疫调节功能。目前，间充质干细胞移植已经成功应用于包括神经系统、消化系统、免疫系统等多个系统的疾病治疗。现有的间充质干细胞诱导方法大多局限于增强其分化成某一种细胞的能力，而缺乏增强提高间充质干细胞整体生物学特性的方法。
技术实现思路
本专利技术针对目前间充质干细胞的广谱应用前景，发展了一种增强提高其多种生物学特性的诱导方法。为此，本专利技术提供了一种增强间充质干细胞多种生物学特性的诱导方法。包括以下步骤：A、不同组织来源的间充质干细胞组织经过不同的处理方法并进行原代细胞培养得到原代细胞，原代细胞培养离心完后的细胞，去掉上清后加入含有血清替代物的干细胞培养基，将细胞沉淀重悬均匀并合并到一个离心管里面，细胞计数板计数；B、将重悬后的细胞悬液接种到含有血清替代物的干细胞培养基的培养瓶中；摇匀放入CO2培养箱培养，培养条件：37±0.5℃、5.0±0.2％的CO2浓度，培养至细胞融合度达到80-90％；种瓶：(1-10)x104cells/cm2接种于T150的培养瓶中，每瓶中加入培养基20ml；按照上述传代方法依次传代，选取P3-P6代次的间充质干细胞为诱导的干细胞来源；所获得的间充质干细胞经过流式细胞仪鉴定纯度。脐带间充质干细胞的诱导处理方法：选取P3-P6代次的间充质干细胞，按照(1-10)x104cells/cm2接种于T150的培养瓶中，每瓶中加入含有1-100ug/ml范围的白花檵木提取物培养基20ml，继续培养48h。本专利技术以脐带间充质干细胞的获取方法为例，阐述间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：(1)取足月健康胎儿脐带，检测脐带血清HbsAg、抗-HCV、抗-HDV、抗-HEV、抗-HIV-1/2、HCV-RNA、HIV-1-RNA、CMV-DNA，检测结果均为阴性，可用；(2)将生理盐水瓶用喷有酒精的纱布擦拭一遍后，去除瓶口处的封口塑料放入处于运行状态的洁净台中；(3)脐带华通氏胶的剥离并洗涤；优选:在生理盐水中洗涤去除脐带血渍，然后浸泡酒精消毒，再次用生理盐水洗涤，在装有生理盐水的培养皿中将将脐带剪成2-3cm小段，并用生理盐水洗涤清除脐带小段血管中的淤血和凝块；然后剥离华通氏胶，用生理盐水进行洗涤；(4)组织块制备剪切脐带华通氏胶：将步骤(3)洗涤后的脐带华通氏胶剪切成1-4mm的组织匀浆；用生理盐水洗涤组织匀浆，进行离心；(5)接种将步骤(4)离心后的组织匀浆去除上清后，接种到接种培养瓶如T150中，并平铺到整个接种培养瓶底面；(6)脐带华通氏胶的培养平置步骤(5)接种培养瓶，放置于CO2培养箱中，6-12个小时后将培养瓶缓慢直立起来，往培养瓶中底部加入含有10wt％血清替代物(商品名称：UltroserGserumsubstitute；货号：15950-017；购自美国pall公司)的干细胞培养基(高糖DMEM培养基)，然后缓慢让它浸润整个组织块；培养条件：37.0±0.5℃，CO2浓度为5.0±0.2％；(7)换液第一次换液：步骤(6)脐带华通氏胶培养到第6-7天进行全量换液；将旧的培养基和未贴壁的组织块倒掉，加入等量的含有10％血清替代物的培养基，平置培养瓶，放置到从CO2培养箱中继续培养；第二次换液：脐带华通氏胶培养到9-10天后，重复第一次换液的操作；第三次换液：在镜像下观察细胞的生长状况，如果细胞融合度没有达到70-80％，在脐带华通氏胶培养到12-13天后，增加一次全量换液的操作；(8)收获原代细胞细胞观察：将所有培养瓶在显微镜下观察，如观察到细胞融合度达到70％-80％时，即可进行消化收获；原代细胞收获：配置细胞消化液：按照体积比1:4的比例混合胰酶与生理盐水，混合液即为细胞消化液。去除旧的培养液：轻轻摇晃培养瓶，使未贴壁组织块脱落，再将组织块和旧的培养液一起倒入废液瓶中；洗涤：往每个去掉旧培养液的瓶中倒入生理盐水，轻轻摇晃培养瓶，使生理盐水液体浸润培养瓶底面和组织块，再将生理盐水倒掉，重复洗涤一次；消化：往洗涤后的每个培养瓶中加入消化液，使每个培养瓶的消化液浸润整个培养瓶底面，静置1min，上下摇晃培养瓶，使消化液充分接触细胞，镜下观察90％的细胞脱落变圆后可停止消化；终止消化：往可终止消化的培养瓶中每瓶加入间充质干细胞培养基，进行终止消化，前后摇晃培养瓶，进行充分接触稀释，然后转移到50ml离心管中离心；(9)原代细胞传代(P0传P1)上一步离心完后的细胞，去掉上清后加入含有血清替代物的干细胞培养基，将细胞沉淀重悬均匀并合并到一个离心管里面，细胞计数板计数；将重悬后的细胞悬液接种到培养瓶并用含有血清替代物的干细胞培养基定容到一定体积，使细胞达到一定浓度；摇匀放入CO2培养箱培养，培养条件：37±0.5℃、5.0±0.2％的CO2浓度，培养至细胞融合度达到80-90％。种瓶：(1-10)x104cells/cm2接种于T150的培养瓶中，每瓶中加入培养基20ml。按照上述传代方法依次传代，选取P3-P6代次的间充质干细胞为诱导的干细胞来源。所获得的间充质干细胞经过流式细胞仪鉴定纯度，符合细胞表型为：CD34/CD45/CD11b/CD19/HLADR(-)，CD90/CD105/CD73(+)。脐带间充质干细胞的诱导处理方法：选取P3-P6代次的间充质干细胞，按照(1-10)x104cells/cm2接种于T150的培养瓶中，每瓶中加入含有1-100ug/ml范围的白花檵木提取物培养基20ml，继续培养48h；所述的白花檵木提取物培养基为在所述的含有血清替代物的干细胞培养基中添加有白花檵木提取物，白花檵木提取物的含量浓度为1-100ug/ml。上述所述的(1-10)x104cells/cm2，优选50000cells/cm2。本专利技术的有益效果是：本专利技术首次发现了白花檵木提取物可以有效整体提高间充质干细胞多种生物学特性，为间充质干细胞发挥更大功效提供了稳定的生物学方法，具体提高的生物学特性包括：①、抗氧化/能力增强；②、增殖能力增强；③、分泌能力增强；④、伤口修复能力增强；⑤、抗衰老能力增强。附图说明图1为本专利技术实施例1白花檵木提取物诱导的脐带间充质干细胞的照片。图2为本专利技术实施例1白花檵木提取本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种增强人间充质干细胞生物学特性的诱导处理方法，其特征在于，包括以下步骤：/nA、不同组织来源的间充质干细胞组织经过不同的处理方法并进行原代细胞培养得到原代细胞，原代细胞培养离心完后的细胞，去掉上清后加入含有血清替代物的干细胞培养基，将细胞沉淀重悬均匀并合并到一个离心管里面，细胞计数板计数；/nB、将重悬后的细胞悬液接种到含有血清替代物的干细胞培养基的培养瓶中；摇匀放入CO2培养箱培养，培养条件：37±0.5℃、5.0±0.2％的CO2浓度，培养至细胞融合度达到80-90％；/n种瓶：(1-10)x10

【技术特征摘要】
1.一种增强人间充质干细胞生物学特性的诱导处理方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、不同组织来源的间充质干细胞组织经过不同的处理方法并进行原代细胞培养得到原代细胞，原代细胞培养离心完后的细胞，去掉上清后加入含有血清替代物的干细胞培养基，将细胞沉淀重悬均匀并合并到一个离心管里面，细胞计数板计数；
B、将重悬后的细胞悬液接种到含有血清替代物的干细胞培养基的培养瓶中；摇匀放入CO2培养箱培养，培养条件：37±0.5℃、5.0±0.2％的CO2浓度，培养至细胞融合度达到80-90％；
种瓶：(1-10)x104cells/cm2接种于T150的培养瓶中，每瓶中加入培养基20ml；
按照上述传代方法依次传代，选取P3-P6代次的间充质干细胞为诱导的干细胞来源；所获得的间充质干细胞经过流式细胞仪鉴定纯度；
脐带间充质干细胞的诱导处理方法：
选取P3-P6代次的间充质干细胞，按照(1-10)x104cells/cm2接种于T150的培养瓶中，每瓶中加入含有1-100ug/ml范围的白花檵木提取物培养基20ml，继续培养48h。


2.按照权利要求1所述的一种增强人间充质干细胞生物学特性的诱导处理方法，其特征在于，间充质干细胞来源包括骨髓、脐带、胎盘、牙髓、脐带血等一切富含间充质干细胞的人体组织。


3.按照权利要求1所述的一种增强人间充质干细胞生物学特性的诱导处理方法，其特征在于，以脐带间充质干细胞的获取方法为例，阐述间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)取足月健康胎儿脐带，检测脐带血清HbsAg、抗-HCV、抗-HDV、抗-HEV、抗-HIV-1/2、HCV-RNA、HIV-1-RNA、CMV-DNA，检测结果均为阴性，可用；
(2)将生理盐水瓶用喷有酒精的纱布擦拭一遍后，去除瓶口处的封口塑料放入处于运行状态的洁净台中；
(3)脐带华通氏胶的剥离并洗涤；
优选:在生理盐水中洗涤去除脐带血渍，然后浸泡酒精消毒，再次用生理盐水洗涤，在装有生理盐水的培养皿中将将脐带剪成2-3cm小段，并用生理盐水洗涤清除脐带小段血管中的淤血和凝块；然后剥离华通氏胶，用生理盐水进行洗涤；
(4)组织块制备
剪切脐带华通氏胶：将步骤(3)洗涤后的脐带华通氏胶剪切成1-4mm的组织匀浆；用生理盐水洗涤组织匀浆，进行离心；
(5)接种
将步骤(4)离心后的组织匀浆去除上清后，接种到接种培养瓶如T150中，并平铺到整个接种培养瓶底面；
(6)脐带华通氏胶的培养
平置步骤(5)接种培养瓶，放置于CO2培养箱中，6-12个小时后将培养瓶缓慢直立起来，往培养瓶中底部加入含有10wt％血清替代物的干细胞培养基，然后缓慢让它浸润整个组织块；
培养条件：37.0±0.5℃，CO2浓度为5.0±0.2％；
(7)换液
第一次换液：步骤(6)脐带华通氏胶培养到第6-7天进行全量换液；将旧的培养基...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘学彬，张成城，刘浩元，
申请(专利权)人：北京中广天一生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11