一种免疫调节功能预授权型间充质干细胞、制备方法及注射液技术

本发明专利技术涉及一种免疫调节功能预授权型间充质干细胞，所述间充质干细胞为预先经过γ‑干扰素IINF‑γ联合肿瘤坏死因子TNF‑α激活的免疫功能预授权型间充质干细胞。本发明专利技术首次应用炎症因子γ‑干扰素和肿瘤坏死因子与间充质干细胞MSCs进行预先共培养，经过该共培养过程，启动/激活了MSCs的免疫调节执行能力，使MSCs预先获得了一致性的免疫调节功能，进入体内后便可快速及时地行使免疫功能调节,克服了当前MSCs所共同存在的由于未授权免疫调节功能而导致的治疗效果差的缺点，同时还避免了由于患者个体炎症差异的微环境所导致的MSCs免疫调节功能不一致的缺陷。优选地，所述间充质干细胞为脐带华通胶间充质干细胞WJMSCs。

【技术实现步骤摘要】
一种免疫调节功能预授权型间充质干细胞、制备方法及注射液
本专利技术涉及生物工程
，具体涉及一种免疫预授权型、可立即一致性行使免疫功能调节的间充质干细胞(MSCs)、其制备方法和含有该间充质干细胞的注射液。
技术介绍
免疫系统是机体的防御体系，一旦异体物质，如细菌病毒和各种异性蛋白侵入危害机体，免疫细胞就会将它们包围、分解、吞噬予以消灭和清除，免疫球蛋白就会大量制造变成抗体对抗入侵者。然而，免疫系统的这种防御功能是处于微妙的动态平衡调节状态，抵御外来入侵，同时识别自身组织，保护机体组织细胞。一旦打破这种平衡，产生对自身组织产生免疫应答反应，或对外来抗原产生过度免疫反应，即可导致临床常见的多种免疫炎性疾病，如类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、免疫炎性动脉粥样硬化、免疫性心肌病及肾脏、肝脏病等等。然而遗憾的是，当前针对发病率、致残率、死亡率日益增加的免疫相关性炎性疾病的治疗尚缺乏安全有效的治疗手段和药物。类固醇类激素及免疫抑制剂虽可部分缓解病情，但长期应用面临感染、肿瘤发生率增加等不良反应。因此，面对自身免疫炎症相关疾病的治疗现状，急需寻找一种替代治疗方案。近年来，大量研究发现，来自中胚层的间充质干细胞MSCs(MesnchymalStemCells)有免疫调节功能。在MSCs治疗对类固醇耐药的55例急性移植物抗宿主病(acuteGvHD)患者的2期临床研究发现，2年缓解率达52％，对照组仅10％。然而，在接下来240例相同入选患者的MSCs治疗的3期临床研究中，却发现无疗效差异。同时，国际上针对多种自家免疫性疾病，如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、溃疡性结肠炎等，应用MSCs治疗的1-2期临床硏究结果也显示了不一致的效果报道。为此，引起了医学界对MSCs免疫调节治疗前景的广泛争议与质疑。最近对MSCs生物学功能的硏究发现，出现上述MSCs免疫调节治疗效果不一致的根本原因是MSCs内在的特殊生物学功能所决定的。硏究发现，MSCs的免疫调节功能不是MSCs本身结构所具有的，而是炎症微环境所赋予MSCs的免疫调节执行“权力”，即生物学上的免疫激活。外源过继输入的MSCs要在体内特有的炎症环境下，即炎症因子作用下能使MSCs具有免疫功能调节能力。激活的MSCs才能通过旁/自分泌功能产生免疫调节因子，及对免疫细胞产生接触调控与抑制，达到有效治疗免疫相关疾病，使其恢复免疫平衡、修复损伤组织、重塑细胞赖以生存的内环境的效果。然而长期以来，由于忽视了对MSCs这一生物学特性及决定其免疫调节功能关键因素的认识，并忽视了对患者的各种免疫炎症相关疾病体内炎症微环境动态变化的认识，而采用了相同细胞、相同剂量、相同单一方法过继治疗，结果导致了治疗失败，以及临床研究产生不一致的治疗效果。
技术实现思路
(一)要解决的技术问题鉴于现有技术的上述缺点、不足，本专利技术提供一种免疫调节功能预授权型间充质干细胞的制备方法，将分离提取的脐带华通胶间充质干细胞(WJMSCs)或其他来源的间充质干细胞MSCs预先与炎性因子γ-干扰素(INF-γ)和肿瘤坏死因子(TNF-a)共培养，制备免疫调节功能预授权型PL-MSCs(Pre-licensingMSCs)，再进一步低氧培养加强其免疫调节功能，得到用于制备药物的免疫活性PL-MSCs，该免疫活性PL-MSCs可现用或低温储存以用于制备注射液等药物产品。本专利技术还涉及该免疫调节功能预授权型PL-MSCs的制备方法及注射液产品。(二)技术方案为了达到上述目的，本专利技术采用的主要技术方案包括：第一方面，本专利技术涉及一种免疫调节功能预授权型间充质干细胞，所述间充质干细胞为预先经过γ-干扰素(IINF-γ)联合肿瘤坏死因子(TNF-α)激活的免疫功能预授权型间充质干细胞。进一步优选地，该间充质干细胞为脐带华通胶间充质干细胞WJMSCs。第二方面，本专利技术涉及一种免疫调节功能预授权型间充质干细胞注射液，其中，所述注射液含有上述免疫调节功能预授权型间充质干细胞，人体白蛋白和生理盐水。优选地，所述注射液的规格为2mL，其中含有所述免疫调节功能预授权型间充质干细胞的数量为(1.9-2.1)×107个，人体白蛋白浓度为0.8-1.2％(质量百分浓度)。该注射液密封4-8度保存，可即刻使用，加入含10％DMSO的无血清培养基，超低温在液氮中可长期保存备用。第三方面，本专利技术实施例提供一种免疫调节功能预授权型间充质干细胞的制备方法，是将分离提取的脐带华通胶间充质干细胞(WJMSCs)预先与炎性因子γ-干扰素(INF-γ)和肿瘤坏死因子(TNF-a)共培养，在培养过程中γ-干扰素和肿瘤坏死因子对WJMSCs的免疫功能进行预先激活，以制备免疫调节功能预授权型PL-WJMSCs。根据本专利技术较佳实施例，其中，所述用于共培养的脐带华通胶间充质干细胞(WJMSCs)是从新生儿脐带中分离的华通胶，经组织贴壁培养及3D培养扩增的三代脐带华通胶间充质干细胞WJMSCs。根据本专利技术较佳实施例，其中，与炎性因子γ-干扰素(INF-γ)和肿瘤坏死因子(TNF-a)共培养完成后，对脐带华通胶间充质干细胞进一步有采用低氧培养处理加强免疫活性。根据本专利技术较佳实施例，其中，所述制备方法包括如下步骤：S1:从新生儿脐带内分离华通胶组织，经组织贴壁培养及3D培养，得到脐带华通胶间充质干细胞(WJMSCs)；S2:将γ-干扰素(INF-γ)、肿瘤坏死因子(TNF-α)和WJMSCs共培养，在培养过程中，利用γ-干扰素(INF-γ)和肿瘤坏死因子(TNF-α)激活WJMSCs，制备得到免疫调节功能预授权型PL-WJMSCs；S3:将PL-WJMSCs低氧培养处理加强其免疫调节功能。上述免疫活性PL-WJMSCs可现用或低温储存，以供制备干细胞注射液等药物产品。根据本专利技术较佳实施例，其中，步骤S1中，从新生儿脐带内分离华通胶组织包括从新生儿脐带内血管间、血管周、羊膜下三部分分离胶样粘液，其具体包括如下步骤：S11:无菌提取剖腹产产妇脐带，置于PBS缓冲液中，洗去脐带表面的血迹；S12:将脐带剪成3-4cm小段，加入生理盐水或PBS缓冲液洗涤血凝块；S13:剪开羊膜，再沿脐静脉腔剪开脐带，撕除脐静脉内膜和外膜，撕取静脉周围、脐静脉与动脉之间、脐动脉周围的疏松结缔组织，收集剥离下来的疏松结缔组织，即得到脐带华通胶组织。根据本专利技术较佳实施例，其中，步骤S1中，所述组织贴壁培养及3D培养包括组织培养和3D培养；具有包括步骤：S21:组织贴壁培养：将剥离下来的疏松结缔组织，剪成1立方毫米以下的组织块，放入无菌细胞培养瓶中贴壁培养，在细胞培养瓶中加入无血清培养基，把含有疏松结缔组织的细胞培养瓶放入37±1℃、体积分数为4-6％的CO2、饱和湿度培养箱中培养，每2-4天更换无血清培养基，观察细胞生长情况；S22:3D培养：当细胞培养瓶中贴壁培养的细胞铺满瓶底80％后，弃细胞培养瓶中的无血清培本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种免疫调节功能预授权型间充质干细胞，其特征在于，所述间充质干细胞为预先经过γ-干扰素IINF-γ联合肿瘤坏死因子TNF-α激活的免疫功能预授权型间充质干细胞。/n

【技术特征摘要】
1.一种免疫调节功能预授权型间充质干细胞，其特征在于，所述间充质干细胞为预先经过γ-干扰素IINF-γ联合肿瘤坏死因子TNF-α激活的免疫功能预授权型间充质干细胞。


2.一种免疫调节功能预授权型间充质干细胞注射液，其特征在于，所述注射液含有权利要求1所述免疫调节功能预授权型间充质干细胞，人体白蛋白和生理盐水。


3.一种免疫调节功能预授权型间充质干细胞的制备方法，其特征在于，将分离提取的脐带华通胶间充质干细胞WJMSCs预先与炎性因子γ-干扰素和肿瘤坏死因子共培养，在培养过程中，γ-干扰素和肿瘤坏死因子对WJMSCs的免疫功能进行预先激活，以制备免疫调节功能预授权型PL-WJMSCs。


4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述用于共培养的脐带华通胶间充质干细胞WJMSCs是从新生儿脐带中分离的华通胶，经组织贴壁培养及3D培养扩增的三代脐带华通胶间充质干细胞WJMSCs；
与炎性因子γ-干扰素INF-γ和肿瘤坏死因子TNF-a共培养完成后，对脐带华通胶间充质干细胞进一步有采用低氧培养处理加强免疫活性。


5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
S1:从新生儿脐带内分离华通胶组织，经组织贴壁培养及3D培养，得到脐带华通胶间充质干细胞WJMSCs；
S2:将γ-干扰素INF-γ、肿瘤坏死因子TNF-α和WJMSCs共培养，在培养过程中，利用γ-干扰素INF-γ和肿瘤坏死因子TNF-α联合激活WJMSCs，制得免疫调节功能预授权型PL-WJMSCs；
S3:将PL-WJMSCs低氧培养处理加强其免疫调节功能。


6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，从新生儿脐带内分离华通胶组织包括从新生儿脐带内血管间、血管周、羊膜下三部分分离胶样粘液，其具体包括如下步骤：
S11:无菌提取剖腹产产妇脐带，置于PBS缓冲液中，洗去脐带表面的血迹；
S12:将脐带剪成3-4cm小段，加入生理盐水或PBS缓冲液洗涤血凝块；
S13:剪开羊膜，再沿脐静脉腔剪开脐带，撕除脐静脉内膜和外膜，撕取静脉周围、脐静脉与动脉之间、脐动脉周围的疏松结缔组织，将剥离下来的疏松结缔组织收集，即得到脐带华通胶组织。


7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述组织贴壁培养及3D培养包括组织培养和3D培养；具有...

【专利技术属性】
技术研发人员：高连如，张宁坤，
申请(专利权)人：高连如，
类型：发明
国别省市：北京;11