CD29抗体在鉴定、分选人胎盘平滑绒毛膜源间充质干细胞中的应用制造技术

本发明专利技术公开了CD29在鉴定、分选人胎盘平滑绒毛膜源间充质干细胞中的应用方法。本发明专利技术中的应用方法是先分别用多种细胞表面标志物标记人胎盘平滑绒毛膜源间充质干细胞(PMSCs)，然后用流式细胞仪进行检测，考察各标记物标记后流式检测的合格率以及稳定性，发现通用标准中的标记物CD90表达不稳定，而CD29标记PMSCs后检测均合格，并且经过重复试验发现，CD29具有良好的检测稳定性，检测合格率100％，表明CD29对PMSCs具有良好且稳定的鉴定效果，可替代CD90用于PMSCs的快速、准确鉴定。

【技术实现步骤摘要】
CD29抗体在鉴定、分选人胎盘平滑绒毛膜源间充质干细胞中的应用
本专利技术属于间充质干细胞鉴定

技术介绍
在生物医学的基础研究或者临床研究中，分析某一个特定细胞群的细胞数量和功能变化的时候，都需要将这群细胞与其他细胞分开，这时就需要根据不同的细胞表面标志物将其分开。细胞表面标志物是指镶嵌在细胞膜脂质双层结构中的膜蛋白，包括膜抗原、膜受体及其他分子，CD分子(ClusterofDifferentiation，分化簇或分化群，也叫白细胞分化抗原)是最常用的细胞表面标志物之一，指应用以单克隆抗体鉴定为主的方法，将来自不同实验室的单克隆抗体所识别的同一分化抗原，包括细胞的特定形态、特定功能和发育阶段。2006年，国际细胞治疗协会(ISCT)规范了间充质干细胞的定义。只有同时符合以下三个标准的细胞，才能称之为间充质干细胞(主要是骨髓来源的间充质干细胞)：①贴壁生长；②细胞表面表达一些特异性抗原(标记物)：阳性(≥95％)：CD90、CD105、CD73，阴性(≤2％)：CD45、CD34、CD11b/CD14、CD19/CD79、HLA-DR；③具有向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞分化的能力。实际实验室操作中，通过组织贴壁培养法培养出的人胎盘平滑绒毛膜源间充质干细胞(PMSCs)，观察贴壁生长的干细胞形态正常，检测的除CD90外其他细胞表面标志物的结果正常，用相应试剂盒评价其向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞分化的能力正常，结果唯独显示，CD90表面标志物稳定性较差，合格率仅为26.19％(统计份数42份)，即按照国际细胞治疗协会(ISCT)公开的标准并不能有效鉴定出合格的人胎盘平滑绒毛膜源间充质干细胞(PMSCs)。并且相关文献的实验结果也指出，人胎盘平滑绒毛膜源间充质干细胞表面标志物CD90的阳性表达量大概率出现阳性表达不足95％的情况。这给鉴定、分选合格的人胎盘平滑绒毛膜源间充质干细胞(PMSCs)带来了困难，也是进一步研究人胎盘平滑绒毛膜源间充质干细胞(PMSCs)功能的障碍。因此，筛选出一种在PMSCs细胞表面高表达且表达稳定性强的细胞表面标志物，可用于准确鉴定、分选合格的人胎盘平滑绒毛膜源间充质干细胞(PMSCs)，作为合格的人胎盘平滑绒毛膜源间充质干细胞PMSCs的鉴定标准，具有十分重要的意义。
技术实现思路
本专利技术筛选出一种在人胎盘平滑绒毛膜源间充质干细胞(PMSCs)细胞表面高表达且表达稳定性强的细胞表面标志物，可替代CD90用于准确鉴定、分选合格的人胎盘平滑绒毛膜源间充质干细胞(PMSCs)，作为合格的人胎盘平滑绒毛膜源间充质干细胞PMSCs的鉴定指标之一。为了达到上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：分别用多种细胞表面标志物标记人胎盘平滑绒毛膜源间充质干细胞(PMSCs)，然后用流式细胞仪进行检测，考察各标记物标记后流式检测的合格率以及稳定性，最终发现CD29标记PMSCs后检测均合格，并且经过重复试验发现，与CD90相比CD29具有良好的检测稳定性，检测合格率100％，表明CD29对PMSCs具有良好且稳定的鉴定效果，可替代CD90用于PMSCs的快速、准确鉴定。本专利技术的有益效果是：本专利技术通过生物学方法筛选出对人胎盘平滑绒毛膜源间充质干细胞(PMSCs)具有良好检测稳定性的标记物CD29，可替代表达不稳定的CD90对PMSCs进行快速且准确的鉴定。附图说明图1为不同来源PMSCs的P0代细胞形态；图2为不同来源PMSCs的P1代细胞形态；图3为不同来源PMSCs的P3代细胞形态；图4为不同来源的PMSCs用CD45标记后的流式检测图；图5为不同来源的PMSCs用CD11b标记后的流式检测图；图6为不同来源的PMSCs用CD34标记后的流式检测图；图7为不同来源的PMSCs用CD19标记后的流式检测图；图8为不同来源的PMSCs用CD29标记后的流式检测图；图9为不同来源的PMSCs用CD73标记后的流式检测图；图10为不同来源的PMSCs用CD90标记后的流式检测图；图11为不同来源的PMSCs用CD105标记后的流式检测图；图12为不同来源PMSCs的成骨分化图；图13为不同来源PMSCs的成脂分化图；图14为不同来源PMSCs的成软骨分化图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术的具体实施方式做详细的说明。实施例1：分离培养人平滑绒毛膜源间充质干细胞分离培养人平滑绒毛膜源间充质干细胞的方法，包括以下步骤：(1)临产前采集母血进行传染病检测，包括梅毒、艾滋、乙肝、丙肝等，选取健康足月的胎盘；(2)剪取胎盘边缘的胎膜组织，将其剪成适当大小，用组织清洗液对胎膜组织进行清洗，洗去血液，然后用组织镊剥除上层羊膜组织后，剥取平滑绒毛膜层，将其置于平皿中进行清洗并剔除残留血管；(3)将分离好的平滑绒毛膜组织转移到50mL离心管中，剪至约1mm3～3mm3的组织块，加入组织清洗液，于700×g，离心清洗5min；(4)向清洗后的平滑绒毛膜组织中加入无血清培养基(包括市售基础培养基DMEM加市售血清替代物，或者用血清培养基，DMEM+胎牛血清)进行重悬，然后接种至培养瓶中，接种密度为6mg/cm2，培养基体积与接种面积比为1:16，在37℃、5％CO2、饱和湿度条件下进行培养；(5)每隔3～4天更换一次培养基，直至P0代细胞融合度达到45％或非P0代细胞融合度达到80％；(6)向培养瓶中加入0.25％胰蛋白酶，对步骤(5)所得细胞进行消化，接着用无血清培养基终止消化，消化完成后，将组织细胞悬液过100μm孔径的筛网去除组织，在细胞悬液中加入0.9％氯化钠注射液进行稀释，500×g，离心清洗3min，然后加入无血清培养基重悬，调整密度为1.0×104个/cm2，接种至培养瓶中进行传代培养，传代培养在37℃、5％CO2、饱和湿度条件下进行；(7)待传代后的细胞融合度达到85％左右时，加入0.25％胰蛋白酶对细胞进行消化，收集细胞，加入0.9％氯化钠注射液进行稀释，500×g，离心清洗3min，然后将预冷的细胞冻存液加入细胞中，重悬细胞使细胞密度为2×106个/mL，然后以1mL/支分装至冻存管中，放入梯度冻存盒，先在-80℃降温24h后再转入气相液氮罐中保存。重复以上操作，选取A、B两组不同来源的PMSCs，显微镜下观察干细胞P0～P3代形态，结果如图1～3所示，形态均正常。实施例2：PMSCs细胞表面标志物检测复苏冻存的A、B组P1代细胞，细胞数量不低于2×106个，离心清洗后分别使用CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-D、CD29、CD73、CD90、CD105等抗体进行标记，用PBS重悬到400μl，用流式细胞仪检测，检测结果如图4～11所示，并统计A、B组细胞流式检测结果的合格率本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.CD29在鉴定、分选人胎盘平滑绒毛膜源间充质干细胞中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.CD29在鉴定、分选人胎盘平滑绒毛膜源间充质干细胞中的应用。


2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
S1：从人胎盘组织中分离并培养干细胞，将分离培养后的干细胞收集冻存，置于梯度冻存盒中，并于-80℃下降温24h后转入液氮中保存；
S2：复苏一批上述冻存的干细胞，使细胞数量不低于2×106个，离心清洗后分别使用CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR、CD29、CD73、CD105抗体进行标记，并用PBS重悬到400μl，对重悬后的细胞用流式细胞仪进行检测；挑选CD29、CD105、CD73表达量≥95％，且CD45、CD34、CD11b、CD19、HLA-DR表达量≤2％的干细胞，即为人胎盘平滑绒毛膜源间充质干细胞。


3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，人胎盘干细胞的分离包括以下步骤：
SS1：取健康足月的胎盘，剪取胎盘边缘的胎膜组织，清洗后剥取平滑绒毛膜组织，剔除残留血管；
SS2：将SS1得到的平滑绒毛膜组织剪成1mm3～3mm3的组织块，加入组织清洗液，于700×g下离心清洗5min；
SS3：向清洗后的平滑绒毛膜组织中加...

【专利技术属性】
技术研发人员：高雪华，孙雯，刘倩伶，曾焰，江蕊利，侯爽，海泉，
申请(专利权)人：成都清科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51