一种负载脂肪干细胞的自体富血小板纤维蛋白凝胶及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种负载脂肪干细胞的自体富血小板纤维蛋白凝胶及其制备方法与应用，该制备方法包括以下步骤：(1)采集自体血液于

【技术实现步骤摘要】
一种负载脂肪干细胞的自体富血小板纤维蛋白凝胶及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于生物材料
，具体涉及一种负载脂肪干细胞的自体富血小板纤维蛋白凝胶及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]富血小板纤维蛋白(PRF)，是继富血小板血浆后第二代血小板浓缩制品，被定义为一个自体的白细胞和富血小板纤维生物材料；是一种包含白细胞和富血小板纤维蛋白基质的浓缩物，PRF的分子结构类似于天然血凝块，可以借助细胞因子的调节作用以及纤维蛋白的支架作用进行组织修复。PRF的主要作用机制包括：
①
引导损伤部位组织的血管新生；
②
促进上皮增殖，封闭损伤部位；
③
网络免疫细胞，进行炎症调节；
④
引导循环血中干细胞的迁移、增殖和分化。PRF能够促进软、硬组织的生长，有赖于其内的多种生长因子，转化生长因子
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β(TGF
‑
β)可以刺激血管和纤维组织生成，对成骨细胞前体有趋化和有丝分裂原作用，抑制破骨细胞进而刺激骨形成，调节其他生长因子的有丝分裂功能，刺激或抑制上皮细胞、成纤维细胞和成骨细胞的有丝分裂；血小板衍生生长因子
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AB(PDGF
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AB)促进间充质干细胞的分化和生长，刺激血管内皮细胞的分裂，加速血管增生，激活胶原酶而促进胶原蛋白的合成，增加巨噬细胞的活化性以促进创伤部位的修复；类胰岛素生长因子(IGF)刺激软骨、骨基质形成，促进成骨细胞前体、成骨细胞复制，增加骨基质蛋白(如骨钙素)的表达；血管内皮细胞生长因子(VEGF)促进血管生成；表皮生长因子(EGF)促进细胞增殖，增加物质的转运和糖酵解，增强皮肤组织、角膜上皮组织、肺和支气管上皮组织的增殖和分化。此外，PRF中富含白细胞细胞因子，如白细胞介素(IL)
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1β、IL
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4、IL
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6、肿瘤坏死因子(TNF)
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α等，它们在抗炎与免疫调节中发挥重要作用。在PRF形成过程中，由于缓慢的共聚过程使得PRF的纤维结构疏松，有助于细胞的迁移和可溶性分子的保留，与此同时，大量血小板被激活，释放出的细胞因子与纤维共聚分子结构密切结合，使得细胞因子的生命跨度延长，在7～14d内持续、缓慢地释放细胞因子，为参与组织再生的间充质干细胞提供生物性的生长环境。目前已广泛应用于口腔科、颌面外科、骨科、整形外科等，主要制备成膜状，用于创面的修复等。
[0003]脂肪干细胞(ADSCs)是从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞，主要恢复组织细胞的修复功能，促进细胞的再生，恢复年轻面容的同时，身体机能也得到充分改善，有效改善亚健康、早衰等疾病，由内而外真正的有效抵抗衰老。ADSCs可分泌多种促血管生成因子和抗凋亡因子而抗炎、抗氧化，可抵抗氧自由基的损伤；高水平表达肝细胞生长因子(HGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、胎盘生长因子(PGF)、转化生长因子
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β(TGF
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β)，此外还有成纤维细胞生长因子
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2(FGF
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2)、血管生成素
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1(Ang
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l)和血管生成素
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2(Ang
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2)，有利于建立更好的损伤修复微环境。目前在临床的应用价值主要表现在其组织修复与重建中，其作用机制有两种：
①
ADSCs进入人体后，在适宜的成脂微环境下进行分化实现组织修复再生；
②
ADSCs具有免疫调节作用，其通过与免疫细胞的直接作用或旁分泌的作用，影响免疫细胞的分化和活化，重建机体的免疫平衡，通常两种机制是同时发挥作用的。
ADSCs在一定的微环境中，可分化为血管内皮细胞，在低氧条件下，ADSCs分泌更丰富的细胞因子，可促进血管生长、抑制细胞凋亡、抗缺血、抗炎修复的作用；ADSCs还可以调节T细胞的表达以及分泌细胞因子，此外，ADSCs的旁分泌效应也是调节免疫微环境、促进组织修复的一个重要因素。
[0004]现有技术获得的PRF是静脉抽自体血液10mL，置于无抗凝血酶的无菌试管中，立即将试管以3000r/min离心10min；静置后，血液样本可分为3层，在位于底层的红细胞碎片和位于顶层的淡黄色澄清液体血小板血浆之间，取出中间层的淡黄色凝胶，即为富血小板纤维蛋白；弃上清，去除凝胶状物底部的红细胞部分，获得初级的PRF凝胶，再将其静置于干燥消毒的容器内10min，使其自然收缩并释放其内的血清，或用无菌纱布吸附血清，同时经挤压塑形制备出具有一定形态、弹性及韧性的富血小板纤维蛋白膜。一般用于临床使用的大都是新鲜制备的PRF，采血之后立即离心，立即激活成膜后立即植入体内，该方法在临床上是具有局限性的。

技术实现思路

[0005]针对上述现有技术，本专利技术提供一种负载脂肪干细胞的自体富血小板纤维蛋白凝胶及其制备方法与应用，以解决现有技术制备的PRF必须立即使用、使用方式单一、应用受限等问题。
[0006]为了达到上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：提供一种负载脂肪干细胞的自体富血小板纤维蛋白凝胶的制备方法，包括以下步骤：
[0007](1)PRF制备：采集自体血液于
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10～
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30℃离心，静置后取中间层淡黄色的富血小板纤维蛋白于
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80℃及以下温度中冷冻保存，得未激活状态的PRF；
[0008](2)负载脂肪干细胞的自体富血小板纤维蛋白凝胶的制备：将未激活状态的PRF于4℃解冻后，与脂肪干细胞悬液按体积比1:1混合，即得。
[0009]PRF多单独用于创面修复和成骨研究，ADSCs多用于组织修复和重建，通过在体外扩增后植入体内。本专利技术结合二者的结构特点、生长特性、作用机制和应用范围，将PRF和ADSCs的技术改进后进行融合创新，扩宽其应用范围。
[0010]本专利技术通过采集自体血液后立即低温冷冻离心，分离获取中间层淡黄色富血小板纤维蛋白(PRF)，将富血小板纤维蛋白(PRF)放入
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80℃冷冻保存，在使用前将
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80℃冷冻的富血小板纤维蛋白(PRF)低温解冻后采用三通注射器加入脂肪干细胞(ADSCs)，混合PRF和ADSCs形成负载脂肪干细胞的自体富血小板纤维蛋白溶液后可进行注射，PRF在体内激活后成胶，结合ADSCs形成一种负载脂肪干细胞的自体富血小板纤维蛋白凝胶，PRF释放因子可作用于受损组织、促进ADSCs的生长，ADSCs也可激活PRF中的免疫细胞向促进修复方向分化，进而促进组织修复。PRF能促进ADSCs细胞分泌VEGF细胞因子，共同培养更能促进VEGF细胞因子的分泌，从而促进组织修复。
[0011]本专利技术工艺改进后的PRF可直接进行注射，不局限于以往体外形成膜状凝胶后植入的技术，简化了操作方法。工艺改进后的PRF可暂时保存于
‑
80℃温度下，不是必须立即使用，改本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种负载脂肪干细胞的自体富血小板纤维蛋白凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)PRF制备：采集自体血液于
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10～
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30℃离心，静置后取中间层淡黄色的富血小板纤维蛋白于
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80℃及以下温度中冷冻保存，得未激活状态的PRF；(2)负载脂肪干细胞的自体富血小板纤维蛋白凝胶的制备：将未激活状态的PRF于4℃解冻后，与脂肪干细胞悬液按体积比1:1混合，即得。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：离心条件为500～700g离心5～10min。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述脂肪干细胞悬液由以步骤制得：(1)脂肪干细胞分离：将脂肪组织预处理后，用0.1wt％的Ⅰ型胶原酶于37℃、160rpm震荡消化3h，其后加入终止消化液终止消化，接着过滤消化液，再于常温下离心，其后收集沉淀加入细胞培养基重悬，得重悬液；(2)细胞传代：将重悬液于37℃、5％CO2环境中培养，培养48h后换液，72h后传代，并采用0.25wt％胰蛋白酶消化贴壁细胞，后续传代时待细胞长至融合度80％以上时，进行传代；(3)脂肪干细胞悬液制备：将P3代脂肪干细胞培养至80％以上融合度时，用0.25...

【专利技术属性】
技术研发人员：王洁，王翔，海泉，
申请(专利权)人：成都清科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：