一种利用人诱导多能干细胞制备临床级别间充质干细胞制剂的方法技术

本发明专利技术提供了一种利用人诱导多能干细胞制备临床级别间充质干细胞制剂的方法，属于细胞培养技术领域。利用人诱导多能干细胞制备临床级别间充质干细胞制剂的方法包括：诱导分化iPSC至iPSC‑MSC并扩增iPSC‑MSC和制备iPSC‑MSC制剂，其中还包括iPSC‑MSC特性的鉴定和iPSC‑MSC制剂的质控。本发明专利技术制备的临床级别间充质干细胞制剂具备为各种病人的个体化需求提供来源无限、质量稳定、同质性高、相对可控的间充质干细胞来源等优势，实现规模产业化，同时具有临床应用市场前景广阔的特点。

【技术实现步骤摘要】
一种利用人诱导多能干细胞制备临床级别间充质干细胞制剂的方法
本专利技术属于细胞培养
，具体涉及一种利用人诱导多能干细胞制备临床级别间充质干细胞制剂的方法。
技术介绍
器官组织内及体外培养的间充质干细胞(Mesenchymalstem/stromalcell,MSC)都具有天然的高异质性，既是其发挥多重功能活性的基础，也是影响MSC实验重复性、MSC质量乃至临床疗效的限制因素，给标准化和规范化评估MSC治疗的安全性和有效性造成了更多的变数和困难。基于细胞重编程技术的人诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcell，iPSC)及相关研究，显著提升了对干细胞维持多能性和干性及其分子调控机理的理解，同时也提供一个无限的病人特异性个体化干细胞的来源。随着非整合iPSC诱导技术的改进和优化，目前已可获得不含病毒载体和致瘤基因c-myc的iPSC。iPSC-MSC仍具有iPSC的优势，可从个体皮肤成纤维细胞或各种组织细胞诱导而成，免除异体移植相关的排斥、疾病传输、伦理等相关问题；iPSC从原理上来说可以无限传代，故MSC的来源可以无穷无尽；理论上由单个iPSC细胞克隆衍生的MSC，其同质性更高。基于这些特点，iPSC可提供稳定可靠的适合各种病人个体化需求的无限MSC来源，可用于体外无限扩增的规模化制备和生产，最终产品的质量稳定、相对可控，针对特定的临床疾病和个体化需求，可达到最优的治疗效果。然而，目前现有技术的缺陷及临床需要，关节软骨损伤和退行性疾病在细胞移植治疗和组织工程中间充质干细胞仍存在来源有限、质量不稳定、同质性不高的难题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种利用人诱导多能干细胞制备临床级别间充质干细胞制剂的方法，满足市场对质量稳定可靠、适合各种病人个体化需求的间充质干细胞来源的需求，建立体外无限扩增的规模化制备和生产技术。本专利技术提供了一种利用人诱导多能干细胞制备临床级别间充质干细胞制剂的方法，包括以下步骤：1)当人iPSC于6孔板中长至80～90％时，更换iPSC-MSC诱导培养基进行培养8～12d，每2～3d换液一次，获得贴壁细胞，消化，得到iPSC-MSC单细胞；2)将所述iPSC-MSC单细胞按8×104cell/cm2接种至25cm2细胞培养瓶中，定义为iPSC-MSC-P0，更换iPSC-MSC生长培养基进行培养4～7d，每2～3d换液一次，消化，以4×104cell/cm2接种至25cm2细胞培养瓶中，定义为iPSC-MSC-P1，在iPSC-MSC生长培养基中继续培养4～7d，每2～3d换液，消化，以2×104cell/cm2接种至75cm2细胞培养瓶中，以后的每4～7d待细胞长至80～90％时，以1×104cell/cm2接种至175cm2细胞培养瓶，以1:3～1:4传代，得到大量的iPSC-MSC-P3细胞；所述iPSC-MSC诱导培养基为含体积浓度2～5％人源血小板裂解物、体积浓度1％100×微量非必需氨基酸溶液、体积浓度1％100×谷氨酰胺添加剂、1.0g/LD-葡萄糖的DMEM培养基；所述iPSC-MSC生长培养基为含体积浓度2～5％人源血小板裂解物、体积浓度1％100×微量非必需氨基酸溶液、体积浓度1％100×谷氨酰胺添加剂、4.5g/LD-葡萄糖的DMEM培养基；3)将采用临床级别的无血清RecoveryTMCellCultureFreezingMedium冻存液中按1×106～1×1010个/mL的浓度分装所述iPSC-MSC-P3细胞，制备的间充质干细胞制剂保存于细胞库。优选的，步骤1)或步骤2)中所述消化用酶为TrypLETMSelect；所述消化的时间为5～8min。优选的，所述消化后进行离心；所述离心的转速为1000～1500rpm；所述离心的时间为3～7min。优选的，步骤2)中所述培养的温度为36～38℃。优选的，步骤1)中所述人iPSC的培养方法为将人iPSC细胞株接种于包被有10μg/ml人多能干细胞培养贴壁基质的6孔板中在iPSC培养基中于37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养5～7d，每天更换新鲜培养基。优选的，每1000μL的所述人多能干细胞培养贴壁基质包括960μlCellAdhereTMDilutionBuffer和40ul250μg/ml的VitronectinXFTM。优选的，所述iPSC培养基为TeSRTM-E8TMBasalMedium和25×TeSRTM-E8TMSupplement，两者体积比为24:1。优选的，所述分装前，对iPSC-MSC特性进行鉴定。所述iPSC-MSC特性的鉴定指标包括干细胞特异性抗原、成骨、成软骨和成脂分化能力。优选的，所述干细胞特异性抗原的鉴定方法包括测定iPSC-MSC表面标志物；所述iPSC-MSC表面标志物包括CD73+、CD90+、CD105+、CD34-、CD45-和HLA-DR-；CD73+、CD90+和CD105+表达均超过95％为阳性，CD34-、CD45-和HLA-DR-表达小于1％为阴性。所述成骨、成软骨和成脂分化能力的鉴定为利用商品化的成骨、成软骨、成脂分化诱导试剂盒进行iPSC-MSC成骨、成软骨和成脂诱导，并分别采用茜素红、甲苯胺蓝、油红O染色评估iPSC-MSC体外成骨、成软骨、成脂分化能力；茜素红、甲苯胺蓝、油红O染色均为阳性，iPSC-MSC具备体外成骨、成软骨、成脂多向分化能力。优选的，还包括间充质干细胞制剂的质控。按照国际细胞治疗协会和/或部分地参照国家食药监局的关于成体干细胞的部分标准，对细胞产品进行检定、评价，提出相关流程、技术和规范，均合格的为成品；细胞产品的检定和评价指标包括细胞活性、细胞质量和添加物质量。本专利技术提供的利用人诱导多能干细胞制备临床级别间充质干细胞制剂的方法，是通过戒除异种血清产品无滋养层细胞的体系(以免除异源病菌和细胞的污染)从人诱导多能干细胞分化并扩增培养出间充质干细胞，与其他来源的间充质干细胞相比，具有来源无限、质量稳定、同质性高、相对可控等优势，可为各种病人的个体化需求提供可靠的间充质干细胞并能为临床研究相关疾病及靶向药物提供重要的细胞模型，其规模产业化和临床应用市场前景非常广阔。附图说明图1为本专利技术人诱导多能干细胞来源间充质干细胞过程中的不同时间点光镜下的形态；图2是本专利技术人诱导多能干细胞来源间充质干细胞的表面标志物流式鉴定图；图3是本专利技术人诱导多能干细胞来源间充质干细胞体外成骨、成软骨、成脂定向诱导分化图。具体实施方式本专利技术提供了一种利用人诱导多能干细胞制备临床级别间充质干细胞制剂的方法，包括以下步骤：1)当人iPSC于6孔板中长至80～90％时，更换iPSC-MSC诱导培养基进行培养8～12d，每2～3d换液一次，获得贴壁细胞，消化，得到iPSC-MSC单细胞；2)将所述iPSC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用人诱导多能干细胞制备临床级别间充质干细胞制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)当人iPSC于6孔板中长至80～90％时，更换iPSC-MSC诱导培养基进行培养8～12d，每2～3d换液一次，获得贴壁细胞，消化，得到iPSC-MSC单细胞；/n2)将所述iPSC-MSC单细胞按8×10

【技术特征摘要】
1.一种利用人诱导多能干细胞制备临床级别间充质干细胞制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)当人iPSC于6孔板中长至80～90％时，更换iPSC-MSC诱导培养基进行培养8～12d，每2～3d换液一次，获得贴壁细胞，消化，得到iPSC-MSC单细胞；
2)将所述iPSC-MSC单细胞按8×104cell/cm2接种至25cm2细胞培养瓶中，定义为iPSC-MSC-P0，更换iPSC-MSC生长培养基进行培养4～7d，每2～3d换液一次，消化，以4×104cell/cm2接种至25cm2细胞培养瓶中，定义为iPSC-MSC-P1，在iPSC-MSC生长培养基中继续培养4～7d，每2～3d换液，消化，以2×104cell/cm2接种至75cm2细胞培养瓶中，以后的每4～7d待细胞长至80～90％时，以1×104cell/cm2接种至175cm2细胞培养瓶，以1:3～1:4传代，得到大量的iPSC-MSC-P3细胞；
所述iPSC-MSC诱导培养基为含体积浓度2～5％人源血小板裂解物、体积浓度1％100×微量非必需氨基酸溶液、体积浓度1％100×谷氨酰胺添加剂、1.0g/LD-葡萄糖的DMEM培养基；
所述iPSC-MSC生长培养基为含体积浓度2～5％人源血小板裂解物、体积浓度1％100×微量非必需氨基酸溶液、体积浓度1％100×谷氨酰胺添加剂、4.5g/LD-葡萄糖的DMEM培养基；
3)将采用临床级别的无血清RecoveryTMCellCultureFreezingMedium冻存液中按1×106～1×1010个/mL的浓度分装所述iPSC-MSC-P3细胞，制备的间充质干细胞制剂保存于细胞库。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)或步骤2)中所述消化用酶为TrypLETMSelect；所述消化的时间为5～8min。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述消化后进行离心；所述离心的转速为1000～1500rpm；所述离心的时间为3～7min。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述培养的温度为36～38℃。


5.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：张娟，周光前，
申请(专利权)人：深圳丹伦基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44