一种ApoB抗原特异性间充质干细胞的制备方法及其产品和应用技术

本发明专利技术涉及生物医用材料领域，具体讲，涉及一种ApoB抗原特异性间充质干细胞的制备方法及其产品和应用。ApoB抗原是动脉粥样硬化核心抗原，ApoB抗原特异性间充质干细胞的制备方法为：获得脐带华通胶间充质干细胞；将γ

【技术实现步骤摘要】
一种ApoB抗原特异性间充质干细胞的制备方法及其产品和应用


[0001]本专利技术涉及生物医用材料领域，具体讲，涉及一种ApoB抗原特异性间充质干细胞的制备方法及其产品和应用。

技术介绍

[0002]动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)导致的缺血性心血管病、脑血管病、周围血管病是世界上致死致残第一位原因。近年一个里程碑式突破是争议100年的AS病因的学说终于揭晓。AS是多种炎症因子、细胞因子、免疫细胞网络交叉作用于血管壁形成的慢性免疫炎症。Canakinumab抗炎性血栓形成结果研究(Canakinumab Anti
‑
inflammatory Thrombosis Outcome Study，CANTOS)首次证实应用白细胞介素
‑Ⅰ
β(IL
‑
1β)受体拮抗剂
‑
卡那单抗治疗的冠状动脉粥样硬化患者(N Engl J Med 2017)，结果显示卡那单抗独立于降脂以外，可显著降低心血管事件，第一次以临床结果证实了AS的病因是血管壁免疫介导的慢性炎症。
[0003]然而，遗憾的是卡那单抗的副作用全身性非特异性免疫抑制导致了致死性感染，限制了临床应用。其它的免疫抑制剂如秋水仙碱、氯奎、氨甲喋呤等均因副作用无法应用于临床治疗AS。CANTOS研究证明，寄于厚望的他汀类降脂药也不能干预斑块免疫炎症链条。因此，迄今为止，国际上还没有针对AS免疫炎性病因学有效、且副作用小的治疗手段。
[0004]近年来，细胞生物学研究表明，来源于中胚层具有自我更新、多向分化潜能的间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)有独特的免疫调节功能。已证明不同来源的MSCs对参与冠状动脉粥样斑块炎症反应的固有免疫与获得性免疫过程中的单核/巨噬细胞、NK、DC、T、B淋巴细胞等均具有调控作用。间充质干细胞(MSCs)通过细胞接触表面分子以通讯联络调控免疫功能，如MSCs的表面分子PD
‑
L1、Gal
‑
9、CD200等与免疫细胞表面受体作用，传导抑制性的信号，抑制CD4+CD8+T细胞的增生，使粥样斑块上ApoB+CD4 T细胞大量凋亡，限制了免疫炎症，恢复了免疫平衡。MSCs通过旁/自分泌，释放有大量胞外囊泡及生物因子、免疫调节因子，如：IDO、PGE2、TGF
‑
β、IL
‑
10、TSG
‑
6、HGF等以发挥抗炎症及免疫调节效应。在Apoe
‑
/
‑
高胆固醇小鼠AS模型中，MSCs可有效限制并逆转AS的粥样斑块。
[0005]同时，MSCs分泌大量蛋白分子抑制金属蛋白酶活性(MMP)，稳定细胞外基质成分。减少炎症细胞数量，直接补充及极化抗炎症的M2巨噬细胞，使之抗炎症细胞比值增加，逆转易损斑块，抑制组织金属蛋白活性，降低细胞基质降解，稳定纤维帽，防上斑块破裂及血栓形成等生物学效应。
[0006]大量临床硏究也证实，MSCs的免疫调节效应已有效的治疗了移植抗宿主病及多种自家免疫性病，如克隆氏病、红斑狼疮、类风湿性关节炎等。
[0007]然而MSCs的这种免疫调控作用是非特异性的，在它对AS炎症斑块免疫调控的同时，对全身多系统组织均有非特异免疫功能影响，这不仅造成了MSCs非精准靶点免疫干预导致的效果差，而更重要的是全身多系统免疫抑制造成不良副作用如各种病毒、细菌感染
的机率增加。
[0008]为此，进一步研究又设想，应用AS特异抗原
‑
ApoB肽段免疫诱导对ApoB+CD4T细胞有特异抑制作用的Treg细胞增殖。这一假设在非动脉粥样硬化小鼠，ApoB肽段疫苗接种确实显著提高了ApoB+Treg细胞水平。但AS小鼠模型显示，接种ApoB p18疫苗不但未增加免疫抑制Treg细胞，反而使Treg向表达RORγt or T
‑
bet炎症转录因子的促AS辅助T细胞Th1/Th2表型转化(2020，Circulation)。因此，有人推荐构建类似治疗肿瘤的抗原特异靶向斑块CAR生物工程，即CAR
‑
Treg，但该工程需Treg膜外、跨膜、胞内信号、共刺激信号等基因工程，其构建工程较CAR
‑
T或CAR
‑
NK更复杂，造价更高，显然如此高价制备的产品，不能适合AS这样多发病常见病之常规治疗。
[0009]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0010]本专利技术的首要专利技术目的在于提供一种ApoB抗原特异性间充质干细胞的制备方法。
[0011]本专利技术的第二专利技术目的在于提供该制备方法获得的ApoB抗原特异性间充质干细胞。
[0012]本专利技术的第三专利技术目的在于提供ApoB抗原特异性间充质干细胞的应用。
[0013]本专利技术的第四专利技术目的在于提供含有ApoB抗原特异性间充质干细胞的制剂。
[0014]为了完成本专利技术的专利技术目的，采用的技术方案为：
[0015]本专利技术涉及一种ApoB抗原特异性间充质干细胞的制备方法，至少包括以下步骤：
[0016]S1、获得脐带华通胶间充质干细胞(WJMSCs)；
[0017]S2、将γ
‑
干扰素和脐带华通胶间充质干细胞共培养，刺激脐带华通胶间充质干细胞诱导表达MHC
‑Ⅱ
类分子，获得表达MHC
‑Ⅱ
类分子的抗原提呈细胞(WJMSCs
‑
MHC
‑Ⅱ
)；
[0018]S3、将步骤S2获得的细胞与ApoB p18多肽共培养，产生ApoB抗原特异性间充质干细胞，
[0019]所述ApoB p18多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0020]可选的，在S2中，γ
‑
干扰素的终浓度为50～200ng/mL，优选为200ng/mL；优选的，γ
‑
干扰素共培养的时间为24～48小时，优选为48小时。
[0021]可选的，在S2中，将培养得到的细胞重悬，离心，将细胞沉淀用培养基稀释至密度为0.8～1
×
105个/mL，接种到新的细胞培养瓶中，将γ
‑
干扰素加到细胞培养瓶中进行共培养；优选的，步骤S2中的培养温度为36.5～37.5℃。
[0022]可选的，在S3中，ApoB p18多肽的浓度为0.2～40μg/mL，优选为40μg/mL；进一步优选的，所述培养的温度为36.5～37.5℃，培养的时间为24小时，培养的环境中含有体积百分比浓度为4～6％的CO2。
[0023]可选的，在S3中，培养结束后用酶消化细胞、清洗、离心获得细胞；
[0024]优选的，酶采用质量百分比为0.2％～0.25％胰蛋白酶；更优选的，清洗采用PBS溶液；进一步优选的，离心的条件为800～900g离心力离心4～6min。
本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种ApoB抗原特异性间充质干细胞的制备方法，其特征在于，至少包括以下步骤：S1、获得脐带华通胶间充质干细胞；S2、将γ
‑
干扰素和脐带华通胶间充质干细胞共培养，刺激脐带华通胶间充质干细胞诱导表达MHC
‑Ⅱ
类分子，获得表达MHC
‑Ⅱ
类分子的抗原提呈细胞；S3、将步骤S2获得的细胞与ApoB p18多肽共培养，产生ApoB抗原特异性间充质干细胞，所述ApoB p18多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在S2中，γ
‑
干扰素的终浓度为50～200ng/mL，优选为200ng/mL；优选的，γ
‑
干扰素共培养的时间为24～48小时，优选为48小时。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在S2中，将培养得到的细胞重悬，离心，将细胞沉淀用培养基稀释至密度为0.8～1
×
105个/mL，接种到新的细胞培养瓶中，将γ
‑
干扰素加到细胞培养瓶中进行共培养；优选的，步骤S2中的培养温度为36.5～37.5℃。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在S3中，ApoB p18多肽的浓度为0.2～40μg/mL，优选为40μg/mL；进一步优选的，所述培养的温度为36.5～37.5℃，培养的时间为24小时，培养的环境中含有体积百分比浓度为4～6％的CO2。...

【专利技术属性】
技术研发人员：高连如，张宁坤，陈宇，张燕，
申请(专利权)人：高连如，
类型：发明
国别省市：