N-乙酰-D-乳糖胺在诱导hUC-MSC向神经元细胞分化中的应用制造技术

本发明专利技术公开了N

【技术实现步骤摘要】
N
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乙酰
‑
D
‑
乳糖胺在诱导hUC
‑
MSC向神经元细胞分化中的应用


[0001]本专利技术属于干细胞治疗领域，具体涉及N
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乙酰
‑
D
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乳糖胺在诱导hUC
‑
MSC向神经元细胞分化中的应用。

技术介绍

[0002]中枢神经系统退化或损害会导致不可逆的神经元丧失，并经常出现持续的功能缺陷，给患者、家庭和社会带来巨大的健康和经济负担。虽然目前临床上已采用多种治疗措施并取得了一定进展，但治疗效果仍不尽如意。过去20年，神经保护疗法受到了极大的关注，干细胞的出现为中枢神经系统疾病的治疗开辟了新的途径。
[0003]人脐带间充质干细胞(hUC
‑
MSC)是一种存于脐带华通胶中的干细胞，来源于发育早期的中胚层，形态和生物学特性与骨髓间充质干细胞相似，可以跨胚层诱导分化为骨、软骨、真皮组织、骨骼肌、心肌细胞及神经元等多种类型细胞，在组织再生和创伤修复等方面具有重要作用。目前国内外多家干细胞治疗中心已开展了hUC
‑
MSC治疗帕金森病、脊髓损伤、脑瘫、多发性硬化、老年痴呆、脊髓小脑共济失调等神经系统疾病的临床研究。
[0004]诱导hUC
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MSC向神经元细胞分化是hUC
‑
MSC应用于神经系统疾病研究的重要内容。

技术实现思路

[0005]本专利技术目的在于提供N
‑r/>乙酰
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D
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乳糖胺在诱导hUC
‑
MSC向神经元细胞分化中的应用。
[0006]本专利技术上述目的通过如下技术方案实现：
[0007]N
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乙酰
‑
D
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乳糖胺在体外促进MSC增殖并诱导其向神经元细胞分化中的应用。
[0008]根据上述N
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乙酰
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D
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乳糖胺在体外促进MSC增殖并诱导其向神经元细胞分化中的应用，所述MSC为hUC
‑
MSC。
[0009]N
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乙酰
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D
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乳糖胺在制备促进MSC增殖并诱导其向神经元细胞分化的培养基中的应用。
[0010]根据上述N
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乙酰
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D
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乳糖胺在制备促进MSC增殖并诱导其向神经元细胞分化的培养基中的应用，所述MSC为hUC
‑
MSC。
[0011]有益效果：
[0012]本专利技术发现N
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乙酰
‑
D
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乳糖胺在体外可以促进hUC
‑
MSC增殖并诱导其向神经元细胞分化，因而可以将其用于hUC
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MSC体外诱导培养制备治疗神经疾病的细胞。
附图说明
[0013]图1为倒置显微镜观察的脐带间充质干细胞。
[0014]图2为免疫荧光染色结果。
具体实施方式
[0015]一、材料
[0016]人脐带间充质干细胞购自赛业(广州)生物科技有限公司。DMEM/F12培养液、胎牛血清购自美国Gibco公司。CCK
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8检测试剂、双抗购自上海碧云天生物。N
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乙酰
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D
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乳糖胺购自上海易恩化学技术有限公司，纯度98％。
[0017]二、方法
[0018]1、脐带间充质干细胞的复苏和培养
[0019]取出人脐带间充质干细胞冻存管，立即放入37℃恒温水浴中，解冻溶解后用DMEM/F12培养液洗涤，充分吹打，常温条件1000rpm离心10min，弃上清液，用含有10％胎牛血清和双抗的DMEM/F12培养液重悬细胞并接种，置于37℃、体积分数为5％CO2、饱和湿度条件下培养，24h后全量换液，之后每3d重复操作1次。当贴壁细胞融合达约85％时，按照1:2的比例传代，倒置显微镜观察细胞的生长情况。
[0020]2、CCK
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8法测定细胞增殖活性
[0021]取生长状态良好的人脐带间充质干细胞，用含有10％胎牛血清和双抗的DMEM/F12培养液重悬并接种于96孔培养板中，每孔加入5000个细胞，待贴壁后，药物组更换为含有7.5、15μM N
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乙酰
‑
D
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乳糖胺的完全培养基，对照组更换为不含N
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乙酰
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D
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乳糖胺的完全培养基，置于37℃、体积分数为5％CO2、饱和湿度条件继续培养24h、48h后，弃去96孔板中旧的培养基，每孔加入100μL无血清培养基和10μL CCK
‑
8溶液，混匀继续孵育4h，用酶标仪测定波长在450nm处的吸光度，记录结果OD450值。
[0022]3、诱导分化及免疫荧光染色
[0023]取生长状态良好的人脐带间充质干细胞，用含有10％胎牛血清和双抗的DMEM/F12培养液重悬并接种于24孔培养板中，每孔加入5
×
104个细胞，待贴壁后，药物组更换为含有7.5、15μM N
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乙酰
‑
D
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乳糖胺、2％B27、20μg/L碱性成纤维细胞生长因子和20μg/L表皮生长因子的完全培养基，对照组更换为仅含有2％B27、20μg/L碱性成纤维细胞生长因子和20μg/L表皮生长因子的完全培养基，置于37℃、体积分数为5％CO2、饱和湿度条件继续培养，3d半量换液1次。9d后用免疫细胞化学染色检测细胞表面抗原NSE、GFAP和Nestin：弃去培养液，PBS洗涤后用4％多聚甲醛固定；依次进行0.5％Triton
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X
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100透化处理；3％双氧水孵育以消除内源性过氧化物酶活性；山羊血清封闭，滴加适当比例稀释的NSE、GFAP或Nestin一抗，4℃过夜；滴加生物素化二抗工作液，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液；二氨基联苯胺胺(DAB)显色，苏木素复染；自来水冲洗；显微镜下观察拍照。
[0024]4、数据处理
[0025]采用SPSS17.0统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值
±
SD表示。组间比较采用t检验，p<0.05代表具有显著性差异。
[0026]三、结果
[0027]1、复苏培养
[0028]脐带间充质干细胞复苏良好，倒置显微镜观察到细胞呈旋涡状状生长，符合脐带间充质干细胞的生长特点。倒置显微镜观察参见图1。
[0029]2、细胞增殖活性
[0030]各组OD450值参见表1，通过表1可以看出，药物组脐带间充质干细胞的增殖活性明
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.N
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乙酰
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D
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乳糖胺在体外促进MSC增殖并诱导其向神经元细胞分化中的应用。2.根据权利要求1所述的N
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乙酰
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D
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乳糖胺在体外促进MSC增殖并诱导其向神经元细胞分化中的应用，所述MSC为hUC
‑
MSC。3.N

【专利技术属性】
技术研发人员：ꢀ五一IntClC一二N五零七七五，
申请(专利权)人：宁夏厚泽生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：