AhR抑制剂诱导间充质干细胞成软骨分化、治疗相关疾病的用途制造技术

本发明专利技术公开了AhR抑制剂诱导间充质干细胞成软骨分化、治疗相关疾病的用途。本发明专利技术发现人参环氧炔醇可以通过抑制AhR促进脐带间充质干细胞的增殖和软骨分化，因此将其应用于脐带间充质干细胞体外诱导分化培养有助于克服常规方法在诱导脐带间充质干细胞向软骨细胞分化尚存在增殖力和分化能力弱的不足。化尚存在增殖力和分化能力弱的不足。化尚存在增殖力和分化能力弱的不足。

【技术实现步骤摘要】
AhR抑制剂诱导间充质干细胞成软骨分化、治疗相关疾病的用途


[0001]本专利技术属于干细胞治疗领域，具体涉及一种AhR抑制剂诱导间充质干细胞成软骨分化、治疗相关疾病的用途。

技术介绍

[0002]关节软骨主要由软骨细胞和细胞外基质组成，无血管和神经系统，软骨细胞增殖能力极弱且缺乏再生能力，导致软骨损伤后难以自我修复。目前临床治疗关节软骨损伤的方法有骨髓刺激修复和软骨细胞移植修复，但取得的软骨修复效果不能让人满意。随着科学技术的发展，基于干细胞的相关疗法为治疗软骨损伤提供了新的治疗方向。脐带间充质干细胞可以诱导分化为软骨细胞作为治疗软骨损伤的种子细胞，受到广泛重视。但是，常规方法在诱导脐带间充质干细胞向软骨细胞分化尚存在增殖力和分化能力弱的不足。
[0003]芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor，AhR)属于Per
‑
Arnt
‑
Sim同源域家族成员蛋白，是一种配体激活的核转录因子，可被污染物、微生物、食物和新陈代谢等提供的小分子活化。AhR参与许多重要的生物学过程，如细胞迁移和细胞分化并影响骨骼发育。已有研究表明AhR参与调控人脐带间充质干细胞的增殖和软骨分化，抑制AhR表达可促进人脐带间充质干细胞的增殖和软骨分化(抑制芳香烃受体表达促进人脐带间充质干细胞的增殖和软骨分化，王新伟、赵英杰、李素素、王越业、贾成艳、常艳、魏伟，安徽医科大学学报，2021)。
[0004]人参环氧炔醇为一种天然有机化合物，具有多种活性，但目前还没有对AhR作用以及在调控脐带间充质干细胞增殖和软骨分化方面的报道。

技术实现思路

[0005]本专利技术目的在于提供AhR抑制剂诱导间充质干细胞成软骨分化、治疗相关疾病的用途。
[0006]本专利技术上述目的通过如下技术方案实现：
[0007]AhR抑制剂用于体外促进间充质干细胞增殖并诱导其成软骨分化的用途。
[0008]进一步地，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。
[0009]更进一步地，所述AhR抑制剂为人参环氧炔醇。
[0010]上述AhR抑制剂用于制备促进间充质干细胞增殖并诱导其成软骨分化的培养基的用途，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。
[0011]上述AhR抑制剂用于促进间充质干细胞增殖并诱导其成软骨分化进而治疗软骨损伤相关疾病的用途，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。
[0012]有益效果：
[0013]本专利技术发现人参环氧炔醇可以通过抑制AhR促进脐带间充质干细胞的增殖和软骨分化，因此将其应用于脐带间充质干细胞体外诱导分化培养有助于克服常规方法在诱导脐带间充质干细胞向软骨细胞分化尚存在增殖力和分化能力弱的不足。
附图说明
[0014]图1为倒置显微镜观察的脐带间充质干细胞。
[0015]图2为甲苯胺蓝染色液染色结果。
[0016]图3为Westernblot测定结果。
具体实施方式
[0017]一、材料
[0018]人脐带间充质干细胞、脐带间充质干细胞成软骨诱导分化培养基购自赛业(广州)生物科技有限公司。DMEM/F12培养液、胎牛血清购自美国Gibco公司。CCK
‑
8检测试剂、双抗、BCA蛋白浓度检测试剂盒购自上海碧云天生物。人参环氧炔醇购自源叶生物，纯度≥95％。
[0019]二、方法
[0020]1、脐带间充质干细胞的复苏和培养
[0021]取出人脐带间充质干细胞冻存管，立即放入37℃恒温水浴中，解冻溶解后用DMEM/F12培养液洗涤，充分吹打，常温条件1000rpm离心10min，弃上清液，用含有10％胎牛血清和双抗的DMEM/F12培养液重悬细胞并接种，置于37℃、体积分数为5％CO2、饱和湿度条件下培养，24h后全量换液，之后每3d重复操作1次。当贴壁细胞融合达约85％时，按照1:2的比例传代，倒置显微镜观察细胞的生长情况。
[0022]2、CCK
‑
8法测定细胞增殖活性
[0023]取生长状态良好的人脐带间充质干细胞，用含有10％胎牛血清和双抗的DMEM/F12培养液重悬并接种于96孔培养板中，每孔加入5000个细胞，待贴壁后，药物组更换为含有15、30μM人参环氧炔醇的完全培养基，对照组更换为不含人参环氧炔醇的完全培养基，置于37℃、体积分数为5％CO2、饱和湿度条件继续培养24h、48h后，弃去96孔板中旧的培养基，每孔加入100μL无血清培养基和10μLCCK
‑
8溶液，混匀继续孵育4h，用酶标仪测定波长在450nm处的吸光度，记录结果OD450值。
[0024]3、诱导分化及染色
[0025]取生长状态良好的人脐带间充质干细胞，用含有10％胎牛血清和双抗的DMEM/F12培养液重悬并接种于24孔培养板中，每孔加入5
×
104个细胞，待贴壁后，药物组更换为含有15、30μM人参环氧炔醇的脐带间充质干细胞成软骨诱导分化培养基，对照组更换为不含人参环氧炔醇的脐带间充质干细胞成软骨诱导分化培养基，置于37℃、体积分数为5％CO2、饱和湿度条件继续培养，3d半量换液1次。14d后，弃去培养基，PBS洗涤，在24孔细胞板中每孔加入4％中性甲醛固定30min，然后加入甲苯胺蓝染色液染色30min，PBS清洗后镜下观察。
[0026]4、Western blot测定AhR和软骨分化标志物蛋白的表达水平
[0027]取生长状态良好的人脐带间充质干细胞，用含有10％胎牛血清和双抗的DMEM/F12培养液重悬并接种于24孔培养板中，每孔加入5
×
104个细胞，待贴壁后，药物组更换为含有15、30μM人参环氧炔醇的脐带间充质干细胞成软骨诱导分化培养基，对照组更换为不含人参环氧炔醇的脐带间充质干细胞成软骨诱导分化培养基，置于37℃、体积分数为5％CO2、饱和湿度条件继续培养，3d半量换液1次。14d后，弃去培养基，PBS洗涤，收集细胞、裂解、提取细胞总蛋白，BCA蛋白浓度检测试剂盒对蛋白定量。取40μg总蛋白进行SDS
‑
丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，以含5％脱脂奶粉室温封闭1h，AhR、SOX
‑
9、COL2A1、β
‑
actin一抗4℃孵育12h，TBST
洗膜后加入二抗孵育1h，TBST洗膜、显影，用Image J软件分析。
[0028]5、数据处理
[0029]采用SPSS17.0统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值
±
SD表示。组间比较采用t检验，p<0.05代表具有显著性差异。
[0030]三、结果
[0031]1、复苏培养
[0032]脐带间充质干细胞复苏良好，倒置显微镜观察到细胞呈旋涡状状生长，符合脐带间充质干细胞的生长特点。倒置显微镜观察参见图1。
[0033]2、细胞增殖活性
[0034本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.AhR抑制剂用于体外促进间充质干细胞增殖并诱导其成软骨分化的用途。2.根据权利要求1所述的用途，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。3.根据权利要求1或2所述的用途，所述AhR抑制剂为人参环氧炔醇。4.权利要求1所述的AhR抑制剂用于制备促进间充质干细胞增殖并诱导其成软...

【专利技术属性】
技术研发人员：ꢀ五一IntClC一二N五零七七五，
申请(专利权)人：宁夏厚泽生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：