一种外泌体扩增及保存方法技术

本发明专利技术公开了一种外泌体扩增及保存方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤S1、间充质干细胞的选取；步骤S2、培养上清液的制备；骤S3、将经过步骤S2分离出的上清液中加入助沉试剂混合，依次进行第一离心、第二离心和第三离心后，得到的沉淀为干细胞外泌体；步骤S4、将经过步骤S3制成的干细胞外泌体接种于新的I型胶原包被的细胞板中，采用MSC培养液进行培养，培养过后放到分化培养基上进行诱导分化扩增；步骤S5、将经过步骤S4诱导分化扩增后的外泌体与保护剂混合均匀后，置于深低温冷藏保存。本发明专利技术公开的扩增和保存方法扩增和保存效果，工艺简单，操作控制方便，扩增速度快，稳定性好，扩增的灵敏度和准确高。的灵敏度和准确高。

【技术实现步骤摘要】
一种外泌体扩增及保存方法


[0001]本专利技术属于分子生物学
，尤其涉及一种外泌体扩增及保存方法。

技术介绍

[0002]外泌体(Exosomes)，或称细胞外囊泡(EV)，是数种起源与功能不同的，具有双层膜结构，直径为30nm～200nm的囊泡结构。其功能有参与细胞之间的信息传递与物质交换、对宿主病原体相互关系的调节、炎症反应的介导等。外泌体的成分包括DNA、RNA、糖类、脂类与蛋白质等，由于其参与多种生理与病理过程，其成分可以作为对多种传染性疾病与肿瘤诊断的生物标志物。
[0003]对外泌体进行扩增和保存是从基因根源入手，提高传染性疾病与肿瘤诊断的准确性，减小患者生理痛苦，有效改善损伤器官问题，根据不同用户的疾病进行精准治疗，从而达到更好的治疗效果的有效措施。然而，现有技术中对外泌体的扩增和保存方法鲜有报道，进而限制了外泌体的进一步应用。仅有的部分报道涉及到的扩增和保存方法也或多或少存在工艺复杂，操作控制不方便，成本高，扩增速度慢且稳定性不好，扩增的灵敏度和准确不高，易出现错配，扩增和保存效果不好的缺陷。
[0004]中国专利技术专利申请CN112662739A公开了一种用于NGS平台的尿液外泌体RNA提取和文库构建方法，属于医学和生物
通过添加助沉试剂到尿液中实现外泌体有效沉降，解决RNA材料受限的问题，同时采用Trizol试剂直接对外泌体进行RNA提取且去除回溶、纯化步骤，减少RNA在提取中损失和降解，为后续建库提供合格原料。通过修复cDNA损伤，优化末端修复加A、纯化步骤，以及文库扩增反应循环数，使用高保真酶预混液进行PCR扩增进行建库，该文库保存了外泌体分子多样性，为NGS技术在液体活检和诊断的应用提供可靠样本。该方法有效解决了尿液样本外泌体含量低，提取RNA总量低，无法有效建库，利用NGS平台测序的难题。然而其并不涉及外泌体的具体扩增和保存方法，扩增和保存效果有待进一步提高。
[0005]因此，本领域仍然需要一种扩增和保存效果，工艺简单，操作控制方便，扩增速度快，稳定性好，扩增的灵敏度和准确高的外泌体扩增及保存方法。

技术实现思路

[0006]本专利技术的主要目的在于提供一种扩增和保存效果，工艺简单，操作控制方便，扩增速度快，稳定性好，扩增的灵敏度和准确高的外泌体扩增及保存方法。
[0007]为达到以上目的，本专利技术采用的技术方案为：一种外泌体扩增及保存方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0008]步骤S1、间充质干细胞的选取：将间充质干细胞进行传代培养，从中筛选出细胞状态良好、增殖能力强的间充质干细胞；
[0009]步骤S2、培养上清液的制备：对干细胞进行培养，将细胞培养后的培养基，离心去除杂质，分离出培养上清液；
[0010]步骤S3、将经过步骤S2分离出的上清液中加入助沉试剂混合，依次进行第一离心、第二离心和第三离心后，得到的沉淀为干细胞外泌体；
[0011]步骤S4、将经过步骤S3制成的干细胞外泌体接种于新的I型胶原包被的细胞板中，采用MSC培养液进行培养，培养过后放到分化培养基上进行诱导分化扩增；
[0012]步骤S5、将经过步骤S4诱导分化扩增后的外泌体与保护剂混合均匀后，置于深低温冷藏保存。
[0013]优选的，步骤S1中所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脂肪间充质干细胞中的任意一种。
[0014]优选的，步骤S2中所述对干细胞进行培养使用的培养基，其组分及其含量如下：基础培养基15
‑
23g/L，表皮生长因子5
‑
12ng/mL，胎牛血清8
‑
14ng/mL，青霉素80
‑
120u/mL，链霉素100
‑
110μg/mL，田菁粉0.03
‑
0.06mg/mL，鱼蛋白氨基酸发酵液10
‑
20mg/mL。
[0015]优选的，所述基础培养基为DMEM
‑
F12培养液、α
‑
MEM培养基、DMEM培养液中的至少一种。
[0016]优选的，所述鱼蛋白氨基酸发酵液为采用天然绿色发酵工艺常温酿制而成；由宁波吉丰生物科技发展有限公司提供，具体制备方法参见中国专利技术专利号CN201810521499.9实施例1中鱼蛋白氨基酸发酵液的制备方法。
[0017]优选的，所述助沉试剂为水溶液，包括如下含量的各成分：聚甲基吡咯烷酮20
‑
30g/L、氯化钠1～3mol/L、超支化聚甘油50
‑
80g/L。
[0018]优选的，所述超支化聚甘油是超支化聚甘油第4代产品。
[0019]优选的，所述上清液、助沉试剂的体积比为(3
‑
5):2。
[0020]优选的，所述第一离心的离心力为500～800xg，时间5
‑
8min，温度3
‑
6℃。
[0021]优选的，所述第二离心的离心力为2000～3000xg，时间8
‑
10min，温度1
‑
5℃。
[0022]优选的，所述第三离心的离心力为10000～20000xg，时间15
‑
20min，温度4
‑
8℃。
[0023]优选的，步骤S4中所述分化培养基包括：分化基础培养基20
‑
30g/L，胎牛血清10
‑
20ng/mL，诱导因子5～20μg/mL；所述分化基础培养基为DMEM
‑
F12培养液。
[0024]优选的，步骤S5中所述保护剂为四氢嘧啶、氨磷汀按质量比(3
‑
5):1混合形成的混合物。
[0025]优选的，步骤S5中所述外泌体与保护剂的质量比为100:(0.3
‑
1.5)。
[0026]优选的，所述深低温冷藏的温度为
‑
85℃～
‑
40℃。
[0027]优选的，所述诱导因子为促细胞生长剂3CS
‑
NK
‑
B1、3CS
‑
NK
‑
B2、M
‑
CSF、IL
‑
4按质量比1:(0.5
‑
0.8):(0.3
‑
0.6):(0.8
‑
1.2)混合形成的混合物。
[0028]由于上述技术方案运用，本专利技术与现有技术相比具有下列优点：
[0029](1)本专利技术提供的外泌体扩增及保存方法，无需专用设备和仪器，耗能低，操作控制方便，效率高，成本低，适合大规模工业化应用；通过扩增和保存工艺的调整，这些工艺参数相互配合共同作用，使得该方法扩增和保存效果，扩增速度快，稳定性好，扩增的灵敏度和准确高。
[0030](2)本专利技术提供的外泌体扩增及保存方法，步骤S2中所述对干细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种外泌体扩增及保存方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤S1、间充质干细胞的选取：将间充质干细胞进行传代培养，从中筛选出细胞状态良好、增殖能力强的间充质干细胞；步骤S2、培养上清液的制备：对干细胞进行培养，将细胞培养后的培养基，离心去除杂质，分离出培养上清液；步骤S3、将经过步骤S2分离出的上清液中加入助沉试剂混合，依次进行第一离心、第二离心和第三离心后，得到的沉淀为干细胞外泌体；步骤S4、将经过步骤S3制成的干细胞外泌体接种于新的I型胶原包被的细胞板中，采用MSC培养液进行培养，培养过后放到分化培养基上进行诱导分化扩增；步骤S5、将经过步骤S4诱导分化扩增后的外泌体与保护剂混合均匀后，置于深低温冷藏保存。2.根据权利要求1所述的外泌体扩增及保存方法，其特征在于，步骤S1中所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脂肪间充质干细胞中的任意一种。3.根据权利要求1所述的外泌体扩增及保存方法，其特征在于，步骤S2中所述对干细胞进行培养使用的培养基，其组分及其含量如下：基础培养基15
‑
23g/L，表皮生长因子5
‑
12ng/mL，胎牛血清8
‑
14ng/mL，青霉素80
‑
120u/mL，链霉素100
‑
110μg/mL，田菁粉0.03
‑
0.06mg/mL，鱼蛋白氨基酸发酵液10
‑
20mg/mL。4.根据权利要求3所述的外泌体扩增及保存方法，其特征在于，所述基础培养基为DMEM
‑
F12培养液、α
‑
MEM培养基、DMEM培养液中的至少一种。5.根据权利要求1所述的外泌体扩增及保存方法，其特征在于，所述助沉试剂为水溶液，包括如下含量的各成分：聚甲基吡咯烷酮20
‑
30g/L、氯化钠1～3mol/L、超支化聚甘油50
‑
80g/L；所述超支化聚甘油是超支化聚甘油第4代产品。...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄治国，方静纯，姚美玲，
申请(专利权)人：深圳贝蒂斯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：