本发明专利技术公开了一种现货型人脐带源间充质干细胞及其制备方法与应用。所述制备方法包括如下步骤：培养离体的脐带组织块，得到P0代细胞；将P0代细胞传代两次，得到P2代细胞并将其冻存；将冻存的P2代细胞复苏，传代两次，得到P4代细胞并将其冻存；将冻存的P4代细胞复苏，传代一次，得到P5代细胞并将其依次经过消化、洗涤和重悬后，得到所述人脐带源间充质干细胞。本发明专利技术还采取冷冻保存的方式，开发得到人脐带源间充质干细胞冻存制剂，该冻存制剂便于储存，复苏后可直接进行静脉给药，无需换液，避免了配药时可能造成的污染风险，更利于临床使用。且冻存制剂保质期长，货架期内可完成针对制剂功能和安全的多项检测。制剂功能和安全的多项检测。
【技术实现步骤摘要】
一种现货型人脐带源间充质干细胞及其制备方法与应用
[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种现货型人脐带源间充质干细胞及其制备方法与应用。
技术介绍
[0002]间充质干细胞(Mesenchymal stem cell，MSC)是一群来源于中胚层的多能成体干细胞，具有自我更新多向分化、促进组织器官修复和免疫调控等潜能。MSC可从骨髓、脐带、胎盘、脂肪、骨骼、牙髓和子宫内膜等多个组织中分离培养，MSC样细胞也可由胚胎干细胞或多能干细胞分化而来。MSC具有低免疫原性，因不表达CD40、CD80、CD86等共刺激分子和主要组织相容性复合体Ⅱ类分子，所以引起免疫排斥反应的可能性较小。同时因其对免疫细胞的调节效应不受主要组织相容性复合体分子的限制，对自体和异体的免疫细胞都可发挥免疫调节效应。MSC还具有炎症趋化特性，通过感知炎性信号(细胞因子、趋化因子受体和整合素等)而迁移至炎症部位，依赖细胞间直接接触和(或)旁分泌效应而发挥作用，如MSC可通过细胞间直接接触或分泌细胞因子的方式对异常激活的T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞等的增殖、分化和抗体产生等发挥调控效应，多项临床研究证明MSC输注后会显著降低患者体内促炎细胞因子，IFN
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γ、IL
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2、IL
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12和IL
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17A的分泌，MSC促进分泌的IL
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10和TGF
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β可以抑制异常活化的Th1细胞，恢复Th1/Th2平衡，抑制T细胞过度增殖，并通过NKG2D通路抑制细胞毒性CD8+T淋巴细胞的活性。MSC还能以LPS依赖性方式通过其自身分泌的IL
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10和TGF
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β细胞因子的协同作用将巨噬细胞从促炎M1表型重新极化为抗炎M2表型。研究证实经MSC治疗后患者的白细胞计数和中性粒细胞计数降至正常水平，CD3+T细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞的计数也增加至正常水平。
[0003]现有的传统技术，通常选用含有胎牛血清的培养基对干细胞进行培养，同时冻存液常选用90％胎牛血清+10％DMSO的配方，复苏培养后重悬于添加人血清白蛋白的生理盐水中用于注射，无法长期保存。同时细胞产量与生物学活性的维持都存在一定的问题。
技术实现思路
[0004]本专利技术的目的是提供一种人脐带源间充质干细胞及其冻存制剂的制备方法与应用。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术首先提供了一种人脐带源间充质干细胞的制备方法。
[0006]本专利技术提供的人脐带源间充质干细胞的制备方法包括如下步骤：
[0007](1)培养离体的脐带组织块，待从所述脐带组织块爬出的间充质干细胞的细胞融合度为40％
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60％时，得到P0代间充质干细胞；
[0008](2)完成步骤(1)后，将所述P0代间充质干细胞进行传代培养，培养至细胞融合度为60％
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80％时，得到P1代间充质干细胞；
[0009](3)完成步骤(2)后，将所述P1代间充质干细胞进行传代培养，培养至细胞融合度为60％
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80％时，得到P2代间充质干细胞；
[0010](4)完成步骤(3)后，将所述P2代间充质干细胞进行细胞冻存，得到冻存的P2代种子库细胞；
[0011](5)完成步骤(4)后，将所述冻存的P2代种子库细胞复苏并进行传代培养，培养至细胞融合度为60％
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80％时，得到P3代间充质干细胞；
[0012](6)完成步骤(5)后，将所述P3代间充质干细胞进行传代培养，培养至细胞融合度为60％
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80％时，得到P4代间充质干细胞；
[0013](7)完成步骤(6)后，将所述P4代间充质干细胞进行细胞冻存，得到冻存的P4代工作库细胞；
[0014](8)完成步骤(7)后，将所述冻存的P4代工作库细胞复苏并进行传代培养，培养至细胞融合度为60％
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80％时，得到P5代间充质干细胞；
[0015](9)完成步骤(8)后，将所述P5代间充质干细胞依次经过消化、洗涤和重悬后，得到所述人脐带源间充质干细胞。
[0016]上述人脐带源间充质干细胞的制备方法中，所述步骤(1)前还包括如下步骤：取离体的脐带进行消毒，得到消毒后脐带；然后将所述消毒后脐带清洗后剪成1
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2cm小段，得到脐带小段；再将脐带小段清洗后剪成1
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2mm3组织块。
[0017]所述步骤(1)中，采用胎牛血清完全培养基培养离体的脐带组织块。所述培养的方法具体可包括如下步骤：向含有脐带组织块的细胞培养瓶中加入胎牛血清完全培养基，倒置于5％CO2、37℃条件下培养；培养4小时后将细胞培养瓶正置于5％CO2、饱和湿度、37℃条件下继续培养；培养24小时后向细胞培养瓶中补加胎牛血清完全培养基，置于5％CO2、饱和湿度、37℃条件下继续培养；脐带组织块贴块培养7天后，吸弃培养液，向细胞培养瓶中加入胎牛血清完全培养基，置于5％CO2、饱和湿度、37℃条件下继续培养。
[0018]所述步骤(2)中，采用胎牛血清完全培养基进行传代培养。所述传代培养(P0至P1)的方法具体可包括如下步骤：吸弃全部培养基，向细胞培养瓶中加入氯化钠注射液(0.9％)洗涤一次，然后加入TrypLE进行消化，待细胞完全悬浮后再加入氯化钠注射液(0.9％)终止消化，并将细胞悬液移至离心管中；用氯化钠注射液(0.9％)清洗各细胞培养瓶，将清洗得到的细胞悬液一并移入离心管中；将离心管离心(300g离心8分钟)，吸弃上清，用平衡至室温的胎牛血清完全培养基重悬细胞，混匀后取细胞悬液用于计数，计算收获的P0代细胞总数；按照18,000
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20,000个细胞/cm2的密度接种于细胞培养瓶中，每瓶补加胎牛血清完全培养基至标准体积，做好标记后置于5％CO2、饱和湿度、37℃条件下继续培养。
[0019]所述步骤(3)中，采用胎牛血清完全培养基进行传代培养。所述传代培养(P1至P2)的方法具体可包括如下步骤：吸弃全部培养基，向细胞培养瓶中加入氯化钠注射液(0.9％)洗涤一次，然后加入TrypLE进行消化，待细胞完全悬浮后再加入氯化钠注射液(0.9％)终止消化，并将细胞悬液移至离心管中；用氯化钠注射液(0.9％)清洗各细胞培养瓶，将清洗得到的细胞悬液一并移入离心管中；将离心管离心(300g离心8分钟)，吸弃上清，用平衡至室温的胎牛血清完全培养基重悬细胞，混匀后取细胞悬液用于计数，计算收获的P1代细胞总数；按照18,000
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20,000个细胞/cm2的密度接种于细胞培养瓶中，每瓶补加胎牛血清完全培养基至标准体积，做好标记后置于5％CO2、饱和湿度、37℃条件下继续培养。
[0020]所述步骤(4)中，所述细胞冻存的方法具体可包括如下步骤：吸弃全部培养液，向细胞培养瓶中加入氯化钠注射液(0.9％)洗涤一次，然后加入本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种人脐带源间充质干细胞的制备方法，包括如下步骤：(1)培养离体的脐带组织块，待从所述脐带组织块爬出的间充质干细胞的细胞融合度为40％
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60％时，得到P0代间充质干细胞；(2)完成步骤(1)后，将所述P0代间充质干细胞进行传代培养，培养至细胞融合度为60％
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80％时，得到P1代间充质干细胞；(3)完成步骤(2)后，将所述P1代间充质干细胞进行传代培养，培养至细胞融合度为60％
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80％时，得到P2代间充质干细胞；(4)完成步骤(3)后，将所述P2代间充质干细胞进行细胞冻存，得到冻存的P2代种子库细胞；(5)完成步骤(4)后，将所述冻存的P2代种子库细胞复苏并进行传代培养，培养至细胞融合度为60％
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80％时，得到P3代间充质干细胞；(6)完成步骤(5)后，将所述P3代间充质干细胞进行传代培养，培养至细胞融合度为60％
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80％时，得到P4代间充质干细胞；(7)完成步骤(6)后，将所述P4代间充质干细胞进行细胞冻存，得到冻存的P4代工作库细胞；(8)完成步骤(7)后，将所述冻存的P4代工作库细胞复苏并进行传代培养，培养至细胞融合度为60％
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80％时，得到P5代间充质干细胞；(9)完成步骤(8)后，将所述P5代间充质干细胞依次经过消化、洗涤和重悬后，得到所述人脐带源间充质干细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)中均采用胎牛血清完全培养基进行细胞培养；或，所述步骤(5)、步骤(6)、步骤(8)中均采用无血清完全培养基进行细胞培养；或，所述步骤(4)中，所述细胞冻存的方法为用冻存液甲重悬细胞，得到细胞悬液；所述细胞悬液的浓度为3
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106个细胞/mL；或，所述冻存液甲由胎牛血清和二甲基亚砜组成；或，所述胎牛血清和所述二甲基亚砜的体积比为9:1；或，所述步骤(7)中，所述细胞冻存的方法为用冻存液乙重悬细胞，得到细胞悬液；所述细胞悬液的浓度为8
×
106个细胞/mL；或，所述冻存液乙由无血清培养基基础、二甲基亚砜和人血白蛋白溶液组成；或，所述无血清培养基基础、所述二甲基亚砜和所述人血白蛋白溶液的体积比为7:2:1。3.按照权利要求1或2所述方法制备得到的人脐带源间充质干细胞。4.权利要求3所述的人脐带源间充质干细胞在制备人脐带源间充质干细胞冻存制剂中的应用。5.一种人脐带源间充质干细胞冻存制剂，其包括权利要求3所述的人脐带源间充质干细胞和细胞冷冻保...
【专利技术属性】
技术研发人员：张宇，齐奇，张云，侯瑞珍，武文杰，周王谊，王磊，
申请(专利权)人：武汉光谷中源药业有限公司，
类型：发明
国别省市：
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