一种生产、纯化RSPO1细胞因子方法技术

本申请提供一种生产RSPO1细胞因子的方法，该方法包括：培养过表达RSPO1细胞因子的稳转细胞系。本发明专利技术具备以下优点：本发明专利技术以PCDNA3.1为真核表达载体构建的，突破传统病毒载体构建的方法，在非病毒培养的实验室环境下就可以操作，操作简便、安全、生产周期短。本发明专利技术中生产的RSPO1蛋白不是融合蛋白保证了RSPO1蛋白分子量的稳定，本发明专利技术中生产的RSPO1蛋白经过两步纯化后，获得RSPO1蛋白浓度更高纯度更大。纯度更大。

【技术实现步骤摘要】
一种生产、纯化RSPO1细胞因子方法


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及一种生产、纯化RSPO1细胞因子方法。

技术介绍

[0002]干细胞的研究对于未来人类健康应用意义重大，在过去十年，干细胞研究领域取得的关键进展之一就是类器官体系的发展。类器官属于三维(3D)细胞培养物，其表面标志物及细胞结构与同源成体器官相同，同时由于类器官的三维结构，相较传统二维平面细胞结构，研究类器官，更能代表体内的器官细胞相互作用，故类器官的研究对人体组织修复，逆转衰老及个性化药物筛选等多个领域有着重要的意义。
[0003]然而，不同的组织需要含有特定生长因子的细胞培养基，其中RSPO1细胞因子作为WNT信号通路的一员，在类器官发育过程中必不可少，同时对于肠道干细胞的功能和肠上皮的再生至关重要。
[0004]市面上RSPO1蛋白产品多为融合蛋白，蛋白上带有一个绿色荧光蛋白并不纯净，且种属上多为人鼠共用，没有较为纯净的人源性RSPO1蛋白。

技术实现思路

[0005]因此，本专利技术要解决的技术问题在于克服现有技术中的RSPO1蛋白产品多为融合蛋白，蛋白上带有一个绿色荧光蛋白并不纯净，且种属上多为人鼠共用缺陷，从而提供一种较为纯净的人源性RSPO1蛋白。
[0006]本专利技术提供一种生产RSPO1细胞因子的方法，该方法包括：培养过表达RSPO1细胞因子的稳转细胞系。
[0007]优选的，所述方法包括将编码RSPO1细胞因子的序列克隆入真核表达载体，形成重组真核表达载体；
>[0008]重组真核表达载体转入宿主细胞中，形成稳转细胞系。
[0009]优选的，所述RSPO1细胞因子的C端连接标签蛋白。
[0010]优选的，所述标签蛋白为3xFLAG标签。
[0011]优选的，所述真核表达载体为pcDNA3.1。
[0012]优选的，所述宿主细胞为HEK293细胞。
[0013]优选的，培养过表达RSPO1细胞因子的稳转细胞系的方法包括：基础培养、加压培养、扩大培养和蛋白表达培养；
[0014]基础培养基配方为:以500ml计，含有DMEM high clucose(1
×
)440ml、Fetal bovine serum 50ml、Penicillin
‑
streptomycin(100
×
)5ml、Gluta MAX supplement 5ml。
[0015]加压培养所用的培养基为选择培养基；选择培养基为在基础培养基中加入抗性筛选试剂所得；
[0016]所述蛋白表达培养所用的培养基为表达培养基，其中不含有蛋白质；表达培养基配方：以1000ml为计，CD293 medium(1
×
)990ml和Gluta MAX supplement 10ml。
[0017]基础培养基和扩大培养基中均不含有抗性筛选试剂；
[0018]所述加压培养的时间为3
‑
5天，优选为4天；
[0019]所述扩大培养的时间为2
‑
4，优选为3天；
[0020]所述蛋白表达培养的时间为6
‑
8天，优选为7天。
[0021]优选的，所述抗性筛选试剂为G418。
[0022]优选的，所述方法还包括纯化RSPO1细胞因子；所述纯化方法包括超滤法和通过flag标签纯化。
[0023]优选的，所述超滤法所用的滤膜孔径为10kD。
[0024]如下任一所述生物材料也属于本专利技术的保护范围：
[0025](1)重组真核表达载体，将编码RSPO1细胞因子的序列克隆入真核表达载体，形成的重组真核表达载体；
[0026](2)稳转细胞系，将(1)所述重组真核表达载体转入宿主细胞中，形成的稳转细胞系。
[0027]本专利技术具有如下优点：
[0028]1、本专利技术以PCDNA3.1为真核表达载体构建的，突破传统病毒载体构建的方法，在非病毒培养的实验室环境下就可以操作，操作简便、安全、生产周期短。
[0029]2、本专利技术中生产的RSPO1蛋白不是融合蛋白保证了RSPO1蛋白分子量的稳定，
[0030]3、本专利技术中生产的RSPO1蛋白经过两步纯化后，获得RSPO1蛋白浓度更高纯度更大。
[0031]4、本专利技术所构建的表达RSPO1蛋白的稳转细胞系，经10到15天可生产80微克的RSPO1蛋白。
[0032]5、用本专利技术RSPO1蛋白与市售RSPO1蛋白等计量分别培养原代肠癌干细胞，发现本专利培养的肠癌类器官，发育更快，平均生长直径更大，状态更好，成球率更高。
附图说明
[0033]为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0034]图1是实施例1中的pcDNA3.1载体图谱；
[0035]图2是实施例1中的Human R
‑
spondin 1Standard用reagent diluent等比稀释示意图。
[0036]图3是实施例1中的RSPO1蛋白用于类器官生长结果。
具体实施方式
[0037]实施例1
[0038]一、pcDNA3
‑3×
flag
‑
Rspo1载体构建
[0039]1.RCR扩增human Rspo1 CDs区
[0040]1.1PCR模板的获得
[0041]收集在T75细胞培养瓶中生长至80％的A549细胞(肺癌人类肺泡基底上皮细胞)，应用UPure Tissue RNA Kit(新百基，China)提取细胞总RNA。
[0042]1.2RNA反转为cDNA
[0043]使用Script RT Master Mix试剂盒(TaKaRa公司，日本)
[0044]采用无核酸酶的离心管，在冰上配置如下反应体系：
[0045][0046]将上述离心管内的反应体系置于56℃的水浴锅中5min，置于冰上，随后向离心管内加入新的反应体系：
[0047][0048]轻柔混匀离心管内的液体，将离心管置于42℃水浴锅中1h后将离心管置于70℃的金属浴中5min，最终得到cDNA,此时获得的cDNA参悟可直接用于后续PCR实验。
[0049]1.3human Rspo1 CDs序列的扩增
[0050]应用phanta高保真DNA聚合酶(Vazyme,China)扩增human Rspo1 CDs序列(见SEQ ID NO.1第862位
‑
第1653位)。SEQ ID NO.1为human Rspo1 mRNA序列所对应的cDNA序列。R本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生产RSPO1细胞因子的方法，其特征在于，该方法包括：培养过表达RSPO1细胞因子的稳转细胞系。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括将编码RSPO1细胞因子的序列克隆入真核表达载体，形成重组真核表达载体；重组真核表达载体转入宿主细胞中，形成稳转细胞系。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述RSPO1细胞因子的C端连接标签蛋白。4.根据权利要求1
‑
3任一所述的方法，其特征在于，所述标签蛋白为3xFLAG标签。5.根据权利要求2
‑
4任一所述的方法，其特征在于，所述真核表达载体为pcDNA3.1。6.根据权利要求2
‑
5任一所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为HEK293细胞。7.根据权利要求1
‑
6任一所述的方法，其特征在于，培养过表达RSPO...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘源，
申请(专利权)人：深圳贝蒂斯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：