具有改变的遗传密码表的翻译系统技术方案

通过使用在特定密码子框中、用连接酶连接pCpA

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有改变的遗传密码表的翻译系统


[0001]本公开涉及具有改变的遗传密码的翻译系统及其使用方法。

技术介绍

[0002]展示文库是可以进化工程上有效取得与靶标蛋白结合的分子的非常有用的技术。为了应用展示文库取得对任意靶标分子显示高结合能力的分子、或取得与多个表位分别结合的多种分子，需要从具有高多样性的文库淘选。为了构建多样性高的文库，考虑增加其构成单位(构建块)的数目、或增加种类，但在从膜透过性的观点看来分子量有限的情形中，构建块的数目也受限。因此，为了提高文库的多样性增加构建块的种类的手段具有重要意义。
[0003]由于如PURESYSTEM(非专利文献1)的重构的无细胞翻译系统可以调整氨基酸、tRNA、氨酰tRNA合成酶(aminoacyl
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tRNA synthetase；ARS)等构成成分的浓度，可以改变天然的密码子
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氨基酸的对应性。通过应用这样的翻译系统，可以构建导入了20种以上的任意构建块的展示文库，但在应用3碱基密码子的大肠杆菌的翻译系统中，由于存在摆动(wobble)规则，原理上考虑可以导入的构建块的上限是32种。更具体说明时，在密码子的第3个字母和反密码子的第1个字母的配对中，存在“游动”，除了沃森
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克里克(Watson
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Crick)碱基对以外，称为摆动碱基对的G
·
U间的配对也是可能的。因此，由于反密码子GNN解码(decode)NNU和NNC的密码子，反密码子UNN解码NNA和NNG的密码子，无法区别读出这些密码子，可以导入1个密码子框的氨基酸的种类限制为最多2种氨基酸(非专利文献2)。
[0004]迄今，报告了在特定的密码子框中，对NNA和NNG的密码子分配不同的氨基酸(非专利文献3、非专利文献4、专利文献1)，但不存在进一步在相同的密码子框中分配另一其它氨基酸、同时并且正确地区别读出总共3个氨基酸、成功扩展构建块的数目的报告。进一步，在已报告的方法中，认为能够选择的氨基酸的通用性低。此外，在翻译中使用系统外配制的氨酰tRNA的情形中，需要比通过系统内ARS配制的氨酰化tRNA的浓度更高浓度的氨酰tRNA，该情形中也数学显示NNA和NNG密码子的区别读出变难(非专利文献5)。
[0005]在本
中，将各种氨基酸适用于密码子表、和将各密码子正确区别读出进行翻译确定展示文库的质量。对各密码子分配的氨基酸从各自的密码子特异性翻译是非常重要的。
[0006]现有技术文献
[0007]专利文献
[0008]专利文献1：WO2016/154675
[0009]非专利文献
[0010]非专利文献1：Shimizu et al.，Nat Biotechnol.2001；19(8)：751
‑
755.
[0011]非专利文献2：Iwane et al.，Nat Chem.2016；8(4)：317
‑
325.
[0012]非专利文献3：Mukai et al.，Nucleic Acids Res.2015；43(16)：8111
‑
8122.
[0013]非专利文献4：Cui et al.，J Am Chem Soc.2015；137(13)：4404
‑
4413.
[0014]非专利文献5：Frenkel
‑
Morgenstern et al.，Mol Syst Biol.2012；8：572.
[0015]专利技术概述
[0016]专利技术要解决的课题
[0017]迄今也以密码子扩展为目的进行了各种尝试，但不存在明确显示对NNA和NNG的密码子分配不同的氨基酸、正确地区别读出它们的报告。此外，也不存在明确显示在相同的密码子框内分配3个氨基酸、正确地区别读出它们的报告。本专利技术鉴于这样的状况作出，其目的之一是提供可以进行密码子的区别读出的新手段。
[0018]用于解决课题的手段
[0019]此次，本专利技术人在特定的密码子框中因摆动碱基对的存在而难读的NNA和NNG密码子的区别读出方面获得成功。进一步，对相同密码子框的NNU或NNC密码子分配其它氨基酸。实际翻译包含这3个密码子的序列、评价区别读出能力时，成功地从目的密码子特异性翻译仅与其对应的氨基酸、正确的区别读出也被数值确认。
[0020]本公开基于这样的知识，具体地，包含以下〔1〕～〔32〕中示例性记载的实施方式。
[0021]〔1〕
[0022]翻译系统，其包含：具有与由M1M2A表示的密码子互补的反密码子的tRNA和具有与由M1M2G表示的密码子互补的反密码子的tRNA，
[0023]M1和M2分别表示密码子的第1个字母和第2个字母的核苷，M1和M2分别独立地选自腺苷(A)、鸟苷(G)、胞苷(C)、尿苷(U)的任一种，
[0024]相互不同的氨基酸或氨基酸类似物分别与前述2种tRNA结合。
[0025]〔2〕
[0026]〔1〕中记载的翻译系统，其中，可以从由M1M2U、M1M2C、M1M2A、和M1M2G构成的密码子框翻译至少2种氨基酸或氨基酸类似物。
[0027]〔3〕
[0028]翻译系统，其包含：
[0029](i)具有与由M1M2U表示的密码子互补的反密码子的tRNA、具有与由M1M2A表示的密码子互补的反密码子的tRNA、和具有与由M1M2G表示的密码子互补的反密码子的tRNA、或
[0030](ii)具有与由M1M2C表示的密码子互补的反密码子的tRNA、具有与由M1M2A表示的密码子互补的反密码子的tRNA、和与由M1M2G表示的密码子互补的反密码子，
[0031]M1和M2分别表示密码子的第1个字母和第2个字母的核苷，M1和M2分别独立地选自腺苷(A)、鸟苷(G)、胞苷(C)、尿苷(U)的任一种，
[0032]相互不同的氨基酸或氨基酸类似物分别与前述(i)和(ii)中的3种tRNA结合。
[0033]〔4〕
[0034]〔1〕至〔3〕的任一项中记载的翻译系统，其中，可以从由M1M2U、M1M2C、M1M2A、和M1M2G构成的密码子框翻译至少3种氨基酸或氨基酸类似物。
[0035]〔5〕
[0036]〔1〕至〔4〕的任一项中记载的翻译系统，其中，M1和M2是以下的(i)至(X)的任一种：
[0037](i)M1是尿苷(U)，M2是尿苷(U)，
[0038](ii)M1是尿苷(U)，M2是腺苷(A)，
[0039](iii)M1是尿苷(U)，M2是鸟苷(G)，
[0040](iv)M1是胞苷(C)，M2是腺苷(A)，
[0041](v)M1是胞苷(C)，M2是鸟苷(G)，
[0042](vi)M1是腺苷(A)，M2是尿苷(U)，
[0043](vii)M1是腺苷(A本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.翻译系统，其包含具有与由M1M2A表示的密码子互补的反密码子的tRNA和具有与由M1M2G表示的密码子互补的反密码子的tRNA，其中，M1和M2分别表示密码子的第1个字母和第2个字母的核苷，M1和M2分别独立地选自腺苷(A)、鸟苷(G)、胞苷(C)、尿苷(U)的任一种，相互不同的氨基酸或氨基酸类似物分别与所述2种tRNA结合。2.权利要求1中所述的翻译系统，其中，从由M1M2U、M1M2C、M1M2A、和M1M2G构成的密码子框，能够翻译至少2种氨基酸或氨基酸类似物。3.翻译系统，其包含：(i)具有与由M1M2U表示的密码子互补的反密码子的tRNA、具有与由M1M2A表示的密码子互补的反密码子的tRNA、和具有与由M1M2G表示的密码子互补的反密码子的tRNA，或(ii)具有与由M1M2C表示的密码子互补的反密码子的tRNA、具有与由M1M2A表示的密码子互补的反密码子的tRNA、和与由M1M2G表示的密码子互补的反密码子，其中，M1和M2分别表示密码子的第1个字母和第2个字母的核苷，M1和M2分别独立地选自腺苷(A)、鸟苷(G)、胞苷(C)、尿苷(U)的任一种，相互不同的氨基酸或氨基酸类似物分别与所述(i)和(ii)中的3种tRNA结合。4.权利要求1或3中所述的翻译系统，其中，从由M1M2U、M1M2C、M1M2A、和M1M2G构成的密码子框，能够翻译至少3种氨基酸或氨基酸类似物。5.权利要求1至4的任一项中所述的翻译系统，其中，M1和M2是以下的(i)至(x)的任一种：(i)M1是尿苷(U)，M2是尿苷(U)，(ii)M1是尿苷(U)，M2是腺苷(A)，(iii)M1是尿苷(U)，M2是鸟苷(G)，(iv)M1是胞苷(C)，M2是腺苷(A)，(v)M1是胞苷(C)，M2是鸟苷(G)，(vi)M1是腺苷(A)，M2是尿苷(U)，(vii)M1是腺苷(A)，M2是胞苷(C)，(viii)M1是腺苷(A)，M2是腺苷(A)，(ix)M1是腺苷(A)，M2是鸟苷(G)，或(x)M1是鸟苷(G)，M2是腺苷(A)。6.权利要求5中所述的翻译系统，其中，M1和M2是以下的(i)至(vii)的任一种：(i)M1是尿苷(U)，M2是尿苷(U)，(ii)M1是尿苷(U)，M2是鸟苷(G)，(iii)M1是胞苷(C)，M2是腺苷(A)，(iv)M1是胞苷(C)，M2是鸟苷(G)，(v)M1是腺苷(A)，M2是腺苷(A)，(vi)M1是腺苷(A)，M2是鸟苷(G)，或(vii)M1是鸟苷(G)，M2是腺苷(A)。7.权利要求1至6的任一项中所述的翻译系统，其中，所述翻译系统中包含的所述tRNA的每一密码子的浓度是(i)0.8～1000μM、(ii)1...

【专利技术属性】
技术研发人员：西村香绪梨，谷口贵昭，筱原正次郎，笼谷万奈，美细津美树，
申请(专利权)人：中外制药株式会社，
类型：发明
国别省市：