一种修复肌肤用重组人源胶原蛋白及其制备方法技术

本发明专利技术属于生物工程领域，尤其涉及一种修复肌肤用重组人源胶原蛋白及其制备方法。通过种子培养、摇瓶发酵、离心干燥等得到重组人源胶原蛋白，并将其应用到敷贴中，敷贴包括重组人源胶原蛋白原液和载体，将重组人源胶原蛋白原液和载体无菌封装于铝箔袋中，封口后低温辐射灭菌得到敷贴，其中重组人源胶原蛋白原液由重组人源胶原蛋白、促透剂、增稠剂、薰衣草提取物、防腐剂和水组成，制备得到的敷贴能够有效的提高皮肤的含水量，适用于不同情况后的修复。复。复。

【技术实现步骤摘要】
一种修复肌肤用重组人源胶原蛋白及其制备方法


[0001]本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种修复肌肤用重组人源胶原蛋白及其制备方法。

技术介绍

[0002]皮肤因手术、感染、烧烫伤等各种原因形成的瘢痕影响人体美观，可对患者的日常生活和社会活动造成严重影响。随着时代的发展和生活水平的提高，人们对瘢痕美化的要求越来越高，故各种成分的祛疤制剂如硅酮类凝胶、动物胶原蛋白凝胶和类人胶原蛋白凝胶等相继出现。其中重组人源胶原蛋白是利用基因工程技术将人源胶原蛋白的原始基因序列经过优化重组表达得到的，与人体天然胶原蛋白的氨基酸序列高度一致。重组人源胶原蛋白含有丰富的亲水性氨基酸残基，有利于纤维细胞的粘附和增殖，加快胶原蛋白合成和沉积的速度，缩短创伤愈合时间。但是其具有容易被酶水解、热不稳定和难以穿透角质层细胞间的脂质结构的问题。
[0003]申请号为201110327865.5的中国专利公开了一种重组人源胶原蛋白及其制备方法，通过对表达重组人源胶原蛋白基因工程菌的构建、基因工程菌的发酵培养、重组人源胶原蛋白诱导表达及重组人源胶原蛋白的提取纯化得到成品重组人源胶原蛋白，实现了分子水平的操作简单化、胶原蛋白的基因工程菌发酵生产；可诱导表达的毕赤酵母工程菌能实现重组人源胶原蛋白在胞内和胞外的高水平表达，但并未对得到的重组人源胶原蛋白的应用进行研究，尤其是针对不同术后肌肤修复情况的研究。

技术实现思路

[0004]为了解决上述问题，本专利技术提供了一种修复肌肤用重组人源胶原蛋白及其制备方法。通过种子培养、摇瓶发酵、离心干燥等得到重组人源胶原蛋白，并将其应用到敷贴中，制备得到的敷贴能够有效的提高皮肤的含水量，适用于不同情况后的修复。
[0005]本专利技术解决上述问题的技术方案如下：一种修复肌肤用重组人源胶原蛋白的制备方法，包括如下步骤：S1、将在新鲜MD培养基中培养的工程菌按10%
‑
12%的接种量，优选为10%，接种到BMG培养基中，25
‑
28℃，200
‑
400r/min振荡培养过夜，优选为28℃，200r/min，然后接入BMG培养基中继续培养至OD
600
达6.0
‑
8.0；S2、室温下10000
‑
12000r/min离心10
‑
15min，优选为10000r/min离心15min，收集BMG培养基中菌体，以BMM液体培养基重新悬浮菌体，使菌浓OD
600
为3.0，在25
‑
28℃，优选为28℃，自然pH值下，200
‑
400r/min培养24
‑
28h，优选为200r/min培养28h，每6
‑
8h补加甲醇至3%，优选为每6h补加一次；S3、对发酵液进行离心分离，收集上清液，上清液经滤膜过滤后，用Sephadex G100凝胶柱层析分离纯化，再经冷冻干燥得到成品重组人源胶原蛋白。
[0006]进一步地，所述MD培养基：1.34% YNB，4
×
10
‑5% Biotin，2%葡萄糖；固体培养基再
加入终浓度为1.5%的琼脂；所述BMG培养基：100mM磷酸缓冲液，pH为6.0，1.34% YNB，4
×
10
‑5% Biotin，1%甘油（V/V）；所述BMM培养基：100mM磷酸缓冲液，pH为6.0，1.34% YNB，4
×
10
‑5% Biotin，0.5%甲醇（V/V）。
[0007]本专利技术还提供一种由上述制备方法得到的重组人源胶原蛋白在敷贴中的应用，所述敷贴包括重组人源胶原蛋白原液和载体；所述重组人源胶原蛋白原液由以下重量份组分组成：重组人源胶原蛋白8
‑
12份，促透剂6
‑
8份，增稠剂3
‑
6份，薰衣草提取物2
‑
6份，防腐剂2
‑
5份，水40
‑
50份；优选为：重组人源胶原蛋白10份，促透剂6份，增稠剂5份，薰衣草提取物4份，防腐剂3份，水45份；所述载体为非织无纺布。
[0008]进一步地，所述增稠剂为波姆、黄原胶、羟乙基纤维素、丙烯酸酯中的一种或几种混合；防腐剂为甲基氯异噻唑啉酮、2
‑
溴
‑2‑
硝基丙烷
‑
1，3
‑
二醇、甲基异噻唑啉酮、苯氧乙醇、4
‑
羟基苯甲酸甲酯、4
‑
羟基苯甲酸乙酯、4
‑
羟基苯甲酸丙酯、4
‑
羟基苯甲酸异丁酯中的一种或几种混合。
[0009]进一步地，薰衣草提取物的加入能够促进细胞再生，平衡皮脂分泌，对组织的生长和修复有良好的功效。
[0010]进一步地，所述重组人源胶原蛋白原液和所述载体被无菌封装于铝箔袋中，随后封口，并低温辐射灭菌，其中低温辐照灭菌的温度是
‑
20～
‑
10℃、辐照剂量是5
‑
15kGy。
[0011]进一步地，所述促透剂的制备方法为：以四氢呋喃为溶剂，加入己内酰胺和氯甲基环氧乙烷，搅拌均匀后加热回流反应2
‑
4h，优选为4h，生成1
‑
（环氧乙烷
‑2‑
基甲基）氮杂环
‑2‑
酮，即为所述促透剂，反应过程为：。
[0012]进一步地所述重组人源胶原蛋白原液的制备步骤为：S1、以乙醇为溶剂，加入重组人源胶原蛋白和N，N
‑
二异丙基乙胺，混合均匀后向其中添加所述促透剂，升高温度至45
‑
55℃，反应4
‑
6h，优选为升高温度至50℃，反应6h，将得到的反应液置于透析袋中用去离子水透析30
‑
36h，优选为36h，每隔6h换水一次，透析完成后，经离心、冻干得到白色固体；其中离心的条件为：10000
‑
12000r/min条件下离心4
‑
6min，优选为10000r/min条件下离心5min；冻干条件为：
‑
20℃预冻20
‑
24h，
‑
80℃冷冻干燥68
‑
72h，优选为
‑
20℃预冻24h，
‑
80℃冷冻干燥72h；在该步操作中，在碱性溶液下，加入的促透剂，其结构中具有的环氧基发生开环与重组人源胶原蛋白上含有的
‑
NH2发生反应，对重组人源胶原蛋白进行了进一步修饰；其中反应过程为：；S2、将步骤S1得到的白色固体溶解于部分水中，混合均匀后依次加入促透剂和增稠剂，搅拌均匀后得到第一溶液；S3、在剩余水中加入薰衣草提取物和防腐剂，搅拌均匀后得到第二溶液；
S4、在搅拌状态下，向第二溶液中加入第一溶液，添加完成后，持续搅拌本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种修复肌肤用重组人源胶原蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、将在新鲜MD培养基中培养的工程菌按10%
‑
12%的接种量接种到BMG培养基中，25
‑
28℃，200
‑
400r/min振荡培养过夜，然后接入BMG培养基中继续培养至OD
600
达6.0
‑
8.0；S2、室温下10000
‑
12000r/min离心10
‑
15min，收集BMG培养基中菌体，以BMM液体培养基重新悬浮菌体，使菌浓OD
600
为3.0，在25
‑
28℃，自然pH值下，200
‑
400r/min培养24
‑
28h，每6
‑
8h补加甲醇至3%；S3、对发酵液进行离心分离，收集上清液，上清液经滤膜过滤后，用Sephadex G100凝胶柱层析分离纯化，再经冷冻干燥得到成品重组人源胶原蛋白。2.根据权利要求1所述的一种修复肌肤用重组人源胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述MD培养基：1.34% YNB，4
×
10
‑5% Biotin，2%葡萄糖；固体培养基再加入终浓度为1.5%的琼脂。3.根据权利要求1所述的一种修复肌肤用重组人源胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述BMG培养基：100mM磷酸缓冲液，pH为6.0，1.34% YNB，4
×
10
‑5% Biotin，1%甘油。4.根据权利要求1所述的一种修复肌肤用重组人源胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述BMM培养基：100mM磷酸缓冲液，pH为6.0，1.34% YNB，4
×
10
‑5% Biotin，0.5%甲醇。5.根据权利要求1
‑
4任一项所述的制备方法得到的重组人源胶原蛋白在敷贴中的应用，其特征在于，所述敷贴包括重组人源胶原蛋白原液和载体；所述重组...

【专利技术属性】
技术研发人员：王海苗，李想，卢霞，王维斌，汪磊，王攀，徐同勋，生喜印，何鹏，金仲夏，
申请(专利权)人：翔鹏北京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：