深层发酵方法技术

本发明专利技术提供了生产一种或多种目的多肽的深层发酵方法，该方法包括：a)在发酵液中发酵生产该一种多种目的多肽的一种或多种微生物，并且b)将至少一种酶添加至该发酵液中；或与未添加或共表达该至少一种酶时相比，在该一种或多种微生物中共表达该至少一种酶并且将该至少一种酶以足以减少该发酵液的粘度分泌到该发酵液中；以及任选地c)回收该一种或多种目的多肽。多肽。多肽。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】深层发酵方法
[0001]序列表的引用
[0002]本申请含有计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过引用并入本文。


[0003]本专利技术涉及生产目的多肽的深层发酵方法。

技术介绍

[0004]在深层发酵中，发酵粘度是非常重要的。随着粘度增加，对于维持发酵器中发酵液的适当的混合变得越来越有挑战性。不完全混合可能影响细胞生长和导致产物形成速率降低。此外，在需氧发酵中，当粘度增加时，需要更高的搅拌速度和搅拌速率来维持相同的氧传递速率。工业发酵设备的运行通常接近最大搅拌速度/搅拌速率，这意味着增加的粘度可减少氧传递速率，进而对生长和/或生产/生产率造成影响。因此，存在着控制、尤其是减少发酵液(fermentation broth)粘度的需求。

技术实现思路

[0005]为了以最佳方式运行发酵方法和获得最大生产率和产量，高粘度发酵液体(fermentation liquid)导致了许多需要本领域普通技术人员解决的挑战。高粘度发酵液体的一个影响是液体混合变得低效，这会导致重要发酵参数(例如pH、温度和底物浓度)的空间变化。这种空间不均匀可能负面影响发酵性能。其次，高的液体粘度会降低传质速率。在需氧发酵方法中，通常通过给发酵器注射或喷射空气、氧气或其混合物的方式提供氧气。高粘度对高氧从气相转移至液相是有害的，并且这可能降低发酵方法的生产率和产量。此外，在高粘度时，发酵器中的微生物产生的二氧化碳从发酵液转移至气相是低效的。在发酵液体中，高浓度的二氧化碳对生产目的多肽的微生物具有毒性作用，并且因此负面影响生产率和产量。
[0006]令人惊讶的是，本专利技术人发现和当不添加酶时相比，将至少一种酶添加至深层发酵液中会引起粘度降低，该酶优选地包括胞壁质酶、几丁质酶、葡聚糖酶或磷酸二酯酶，更优选地包括胞壁质酶和磷酸二酯酶。即使受本专利技术影响的主要参数是发酵液的粘度，使用本专利技术的本领域普通技术人员可以观察到许多益处，例如改善的液体混合、降低的重要发酵参数的空间变化、改善的摄氧量、改善的二氧化碳去除、提高的生产率以及改善的产量。像这样，本专利技术可以允许保持恒定的粘度但是降低电源输入和/或氧气供应。
[0007]关于添加胞壁质酶，本专利技术人研究了不同类别的胞壁质酶，包括GH22、GH24、GH25、GH64、GH71和GH84。为了进一步研究GH25家族，为了获得最大多样性，建立进化树并用于在整个树中选择酶以实现最大的多样性。以下实例中获得的阳性结果支持在整个GH25家族中，并且也在其他GH家族中发现粘度降低酶有很高的可能性。
[0008]因此，在第一方面，本专利技术涉及生产一种或多种目的多肽的深层发酵方法，该方法包括：
[0009]a)在发酵液中发酵生产该一种多种目的多肽的一种或多种微生物，并且
[0010]b)将至少一种酶添加至该发酵液中；或与未添加或共表达该至少一种酶时相比，在该一种或多种微生物中共表达该至少一种酶并且将该至少一种酶以足以减少该发酵液的粘度分泌到该发酵液中；以及任选地
[0011]c)回收该一种或多种目的多肽。
附图说明
[0012]图1.表达淀粉酶产物的地衣芽孢杆菌菌株在整个分批补料发酵过程中的相对粘度。在发酵40小时后，测量以下批次的相对粘度：未添加溶菌酶的参考批次、通过蔗糖进料连续添加溶菌酶的批次、和直接推注添加溶菌酶至发酵器中的批次。
[0013]定义
[0014]胞壁质酶：术语“胞壁质酶”活性在本文中定义为催化两种或更多种碳水化合物之间、或碳水化合物和非碳水化物部分之间的糖苷键的水解的O
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糖基水解酶。胞壁质酶切割细菌细胞壁的粘多糖和粘肽中的某些残基之间的糖苷键，例如在肽聚糖中的N
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乙酰胞壁酸与N
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乙酰
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D
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葡糖胺残基之间以及在壳糊精中的N
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乙酰
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D
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葡糖胺残基之间的1,4
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β
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键，这导致溶菌作用。胞壁质酶属于EC 3.2.1.17酶类。这包括在材料与方法中描述的胞壁质酶测定中有活性的酶类。
[0015]几丁质酶：术语“几丁质酶”活性在本文中定义为催化两种或更多种碳水化合物之间、或碳水化合物和非碳水化物部分之间糖苷键水解的O
‑
糖基水解酶。几丁质酶切割真菌细胞壁中发现的几丁质中的某些残基之间的糖苷键，例如几丁质和壳聚糖中的N
‑
乙酰葡糖胺残基之间的1,4β
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键。内切几丁质酶(EC 3.2.1.14)在壳多糖链内部位点随机分裂几丁质。外切几丁质酶也分为两种类别：壳体生物酶(Chitobiosidases)(EC 3.2.1.29)和β
‑
1,4
‑
N
‑
乙酰葡糖胺酶(EC 3.2.1.30)。一种优选的几丁质酶的氨基酸序列示于SEQ ID NO:416中。
[0016]葡聚糖酶：术语“葡聚糖酶”活性在本文中定义为催化两种或更多种碳水化合物之间、或碳水化合物和非碳水化物部分之间糖苷键水解的O
‑
糖基水解酶。葡聚糖酶切割真菌细胞壁中发现的聚糖中的某些残基之间的糖苷键，例如在1,3葡聚糖、1,4
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葡聚糖、1,6
‑
葡聚糖、或包括1,3
‑
、1,4
‑
和/或1,6键的混合的葡聚糖中的葡萄糖残基之间的1,3β
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键、1,4β
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键或1,6β
‑
键。
[0017]磷酸二酯酶：术语“磷酸二酯酶”或“PDE”在本文中定义为断裂磷酸二酯键(典型地，在DNA和/或RNA中)的酶。
[0018]共培养：术语“共培养”在本文中定义为发酵方法，其中将两种或更多种微生物接种在相同的发酵器中，并且培养二者来提供发酵液的不同组分。在一种优选的共培养中，一种微生物生产目的多肽，并且第二微生物以足够降低发酵液粘度的量表达和分泌酶。
[0019]表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
[0020]序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性通过参数“序列同一性”来描述。
[0021]出于本专利技术的目的，使用尼德曼
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翁施算法(Needleman
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Wunsch algorithm)
(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443
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453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite[欧洲分子生物学开放软件套件],Rice等人,2000,Trends Genet.本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种生产一种或多种目的多肽的深层发酵方法，该方法包括：a)在发酵液中发酵生产该一种多种目的多肽的一种或多种微生物，并且b)将至少一种酶添加至该发酵液中；或与未添加或共表达该至少一种酶时相比，在该一种或多种微生物中共表达该至少一种酶并且将该至少一种酶以足以减少该发酵液的粘度分泌到该发酵液中；以及任选地c)回收该一种或多种目的多肽。2.如权利要求1所述的方法，其中该一种或多种目的多肽是单个多肽或两种或更多种多肽的混合物。3.如权利要求1或2所述的方法，其中该一种或多种多肽或该两种或更多种多肽的混合物是一种或多种酶，优选地是一种或多种分泌的酶；甚至更优选地，该多肽或该两种或更多种多肽的混合物选自水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、和转移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、磷酸二酯酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α
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半乳糖苷酶、β
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半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α
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葡糖苷酶、β
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葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、β
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木糖苷酶。4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该至少一种酶以推注或连续添加的方式添加。5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该方法是分批补料或连续补料的发酵方法，并且其中将该至少一种酶添加至补料中。6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该至少一种酶选自糖基水解酶家族，优选地是胞壁质酶、几丁质酶、变聚糖酶、甘露聚糖酶、核酸酶和/或磷酸二酯酶；优选地该至少一种酶是胞壁质酶，甚至更优选地是GH24或GH25胞壁质酶；仍更优选地该至少一种酶包含以下氨基酸序列，该氨基酸序列和SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:453中任一个中显示的氨基酸序列或其成熟版本至少60％序列同一性；例如，至少65％序列同一性；例如，至少70％序列同一性；例如，至少75％序列同一性；例如，至少80％序列同一性；例如，至少85％序列同一性；例如，至少90％序列同一性；例如，至少95％序列同一性；例如，至少96％序列同一性；例如，至少97％序列同一性；例如，至少98％序列同一性；例如，至少99％序列同一性；或者甚至100％序列同一性。7.如以上权利要求中任一项所述的方法，该方法包括向每kg发酵液中添加高达20,000mg的该至少一种酶；优选地高达15,000mg/kg；甚至更优选地高达10,000mg/kg；仍更优选地高达5,000mg/kg；甚至更优选地高达1,000mg/kg和以及最优选地高达500mg/kg。8.如以上权利要求中任一项所述的方法，该方法包括当稀释4,000倍时，添加该至少一种酶，其活性范围是低于本文中描述的胞壁质酶测定的检测限，和高达本文中描述的胞壁质酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：J范，X蔡，R穆利金，S科内利森，CK赫尔曼森，AG布鲁纳，K汉森，A迪亚诺，B麦克拜耳，S布朗，T钱德拉，H葛，FK里斯加德，B卡塞尔斯，KJ克里斯滕森，V塞雷达，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：