α-氨基酸酯酰基转移酶在制备L-丙氨酰-L-谷氨酰胺中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种α

【技术实现步骤摘要】
α
‑
氨基酸酯酰基转移酶在制备L
‑
丙氨酰
‑
L
‑
谷氨酰胺中的应用


[0001]本专利技术涉及生物医药
，具体是一种α
‑
氨基酸酯酰基转移酶在制备L
‑
丙氨酰
‑
L
‑
谷氨酰胺中的应用。

技术介绍

[0002]L
‑
丙氨酰
‑
L
‑
谷氨酰胺(L
‑
Alanyl
‑
L
‑
Glutamine，Ala
‑
Gln)属于氨基酸的衍生物，简称丙谷二肽，其结构式如下式所示：
[0003][0004]丙谷二肽具有稳定性较好、高温时无有毒化合物产生、水溶性较谷氨酰胺高出20倍左右、进入有机体内数分钟便可降解成谷氨酰胺等优点，因此其作为最好的谷氨酰胺的载体被广泛研究和使用。
[0005]α
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氨基酸酯酰基转移酶(α
‑
amino acid ester acyltransferase，Aet)是由aet 基因编码的蛋白质，能够以氨基酸甲酯为酰基供体、氨基酸为亲核物质生成二肽，仅产生一种二肽副产物，也能够以氨基酸甲酯和二肽为底物生成多肽。该酶具有广谱性，除碱性氨基酸与色氨酸不适合作为α
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氨基酸酯酰基转移酶的亲核物质；甘氨酸甲酯、丝氨酸甲酯、苏氨酸甲酯不适合作为α
‑
氨基酸酯酰基转移酶的酰基供体外，其余的氨基酸组合均可由α
‑
氨基酸酯酰基转移酶催化合成二肽，在生化药品及营养素的制备中具有重要的应用价值。
[0006]味之素株式会社的中国授权专利CN1316016C公布了来源于Empedobacter brevis ATCC 14234或来源于Sphingobacterium sp.菌株FERMBP
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8124表达的α
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氨基酸酯酰基转移酶，该酶以L
‑
丙氨酸甲酯(L
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alaninemethylester)和L
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谷氨酰胺(L
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glutamine)为底物一步酶法合成丙谷二肽，其合成方法如下式所示；2011年日本科学家Isao A等在 Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry,2011,75(11):2087
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2092上发表的《Gene cloning and charachetrization ofα
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amino acid ester acyltransferase inEepedobacter brevis ATCC14234 and Sphingobacterium siyangensis AJ2458》则公布了来源于siyangensis AJ2458的具有同样酶活性的α
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氨基酸酯酰基转移酶(SAET)，且在丙谷二肽合成时酶活性更高；2013年日本科学家Hirao Y 等在Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry,2013,77(3):618
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623上发表的《Enzymatic production of L
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alanine
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L
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glutamine by recombinant E.coliexpressingα
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amino acid ester acyltransferase from Sphingobacterium siyangensis》公布的以SAET的重组工程菌发酵生产丙谷二肽，在底物浓度524mmol/L 时，使丙谷二肽的产量达到了69.7g/L，转化率达到67％。
[0007][0008]江南大学专利CN104480172A在2015年公开了利用重组大肠杆菌生产 L
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丙氨酰
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L
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谷氨酰胺的方法，其α
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氨基酸酯酰基转移酶基因序列的原始序列，见Genbank ACCESSION AB610978，优化后的氨基酸酯酰基转移酶序列为该专利中的SEQ ID NO:1，重组菌株的发酵液中，L
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丙氨酰
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L
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谷氨酰胺产量可达到30mg/L左右。江苏诚信药业的中国授权专利CN104480075B公布的一种催化合成丙谷二肽的生物酶(该专利中的SEQ ID NO:1)，其同样是以L
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丙氨酸甲酯和L
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谷氨酰胺为底物酶催化合成丙谷二肽，其397mmol 的底物L
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谷氨酰胺可获得收率在80％左右的产物。精晶药业的专利 CN105274174A公开了产物丙谷二肽收率达到80％
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90％的生物酶制备方法，但却未公布生物酶的来源。大连医诺生物的中国授权专利CN106754985B公开了编码丙谷二肽生物合成酶的基因(该专利中SEQ ID NO:1，来源于 Sphingobacterium siyangensis)，其一个实施例在L
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丙氨酸甲酯盐酸盐底物浓度为600mM时利用高效液相色谱法测得丙谷二肽的最高浓度为79.91g/L，摩尔转化率为61％。合肥工业大学的专利申请CN107603936A公开了一种表达α
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氨基酸酯酰基转移酶的重组工程菌，其粗酶液的酶活可达600
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900U/mL，但是没有给出其催化合成丙谷二肽的催化效果数据。邦泰生物的PCT专利申请WO2019157823A1公开了在α
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氨基酸酯酰基转移酶(该专利中SEQ IDNO:1
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SEQ ID NO:6，来源于Elizabethkingia meningoseptica)存在下，以L
‑ꢀ
丙氨酸甲酯盐酸盐(20g)和L
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谷氨酰胺(21g)为底物配制反应液，调节所述反应液的pH为7.0
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9.0，在恒定温度20
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40℃下反应后，收集得到丙谷二肽，转化率可达到90％左右。
[0009]综上，当前国内对丙谷二肽的合成技术也在不断探究中，面对庞大的市场需求，亟需研发出更高效的适合工业化生产的丙谷二肽合成方法。

技术实现思路

[0010]本专利技术所要解决的技术问题是为了克服现有技术中缺少制备L
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丙氨酰
‑ꢀ
L
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谷氨酰胺的具有高酶活、高转化率的α
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氨基酸酯酰基转移酶的不足，提供一种α
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氨基酸酯酰基转移酶在制备L
‑
丙氨酰
‑
L
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谷氨酰胺中的应用本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种α
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氨基酸酯酰基转移酶在制备L
‑
丙氨酰
‑
L
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谷氨酰胺中的应用，所述α
‑
氨基酸酯酰基转移酶具有如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。2.如权利要求1所述的应用，其特征是，所述α
‑
氨基酸酯酰基转移酶具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列时，编码所述α
‑
氨基酸酯酰基转移酶的序列具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。3.如权利要求1所述的应用，其特征是，所述α
‑
氨基酸酯酰基转移酶具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列时，编码所述α
‑
氨基酸酯酰基转移酶的序列具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。4.如权利要求1所述的应用，其特征是，所述α
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氨基酸酯酰基转移酶具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列时，编码所述α
‑
氨基酸酯酰基转移酶的序列具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。5.一种制备α
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氨基酸酯酰基转移酶的方法，其特征是，所述方法包括：(1)构建α
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氨基酸酯酰基转移酶的表达载体；(2)将步骤(1)中构建得到的表达载体转化到宿主菌中，即得转化菌株，所述转化菌株表达α
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氨基酸酯酰基转移酶；所述α
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氨基酸酯酰基转移酶具有如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；较佳地：所述方法还包括：(3)培养步骤(2)得到的转化菌株；和/或，所述表达载体为pET
‑
21a；和/或，所述宿主菌为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)；更佳地：所述培养为将步骤(2)得到的转化菌株在液体培养基例如LB液体培养基中，37℃培养至OD600达到0.7
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0.9，例如0.8时，加入终浓度为0.5mM的IPTG，在22
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26℃，例如25℃下诱导培养12
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18h，例如16h；和/或，所述大肠埃希氏菌为BL21(DE3)菌株。6.如权利要求5所述的方法，其特征是，所述α
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氨基酸酯酰基转移酶具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列时，编码所述α
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氨基酸酯酰基转移酶的序列具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或者，所述α
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氨基酸酯酰基转移酶具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列时，编码所述α
‑
氨基酸酯酰基转移酶的序列具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；或者，所述α
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氨基酸酯酰基转移酶具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列时，编码所述α
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氨基酸酯酰基转移酶的序列具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。7.一种制备L
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丙氨酰
‑
L
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谷氨酰胺的方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：王舒，田振华，徐文选，程占冰，
申请(专利权)人：弈柯莱生物科技上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：