一种提高CRM197蛋白产量的发酵培养方法技术

本申请涉及一种提高CRM197蛋白产量的发酵培养方法，包括种子罐培养：将菌种液和液体培养基投入种子罐中混合为菌种培养液，在36.5

【技术实现步骤摘要】
一种提高CRM197蛋白产量的发酵培养方法


[0001]本申请涉及微生物培养
，具体涉及一种提高CRM197蛋白产量的发酵培养方法。

技术介绍

[0002]白喉毒素(DT)是由白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)的产毒菌株合成和分泌的蛋白质性毒素。CRM197蛋白为白喉毒素的无毒形式，但其在免疫上与白喉毒素没有区别，由不产毒噬菌体β197tox感染的白喉棒杆菌(文中简称为CRM197菌)产生。由于没有毒性的CRM197蛋白仍然可与敏感细胞的受体结合，即CRM197蛋白在丧失酶活性及毒性的同时仍保留白喉毒素的免疫原性，是一种理想的多糖结合疫苗载体蛋白。
[0003]现有制备CRM197蛋白的方法，主要通过发酵培养CRM197菌，从CRM197菌的培养物纯化而得。因此，CRM197菌无论是天然菌种还是重组构建的工程菌种，培养方式是制约CRM197蛋白量产的重要一环。为了提高CRM197蛋白的产量，申请人对发酵使用的培养基做了优化，具体参见申请号为201910651534.3的中国专利技术专利。
[0004]但是按上述的培养方法对菌种进行发酵，CRM197蛋白的产量仍处于较低的水平，因此急需研发一种更为优异的发酵培养方法，使CRM197菌得以大规模扩增而获得高表达量的发酵菌液。

技术实现思路

[0005]本申请提供一种提高CRM197蛋白产量的发酵培养方法，具体通过控制发酵过程中的温度和溶氧量，实现增加CRM197蛋白产量的目的。
[0006]本申请采用如下的技术方案：一种提高CRM197蛋白产量的发酵培养方法，包括以下步骤：种子罐培养：将CRM197菌种液和液体培养基投入种子罐中混合为菌种培养液，在36.5
±
0.5℃的温度下培养至OD
600
值＞10.0收获种子罐菌液；所述菌种培养液在培养时，控制溶氧＞40％；生产罐培养：将所述种子罐菌液和液体培养基投入生产罐中混合为菌种发酵液，培养至OD
600
值＞40.0收获生产罐菌液；当OD
600
值＜15.0时，控制培养温度为27.0
‑
37.5℃，所述菌种发酵液的溶氧＞40％；当OD
600
值≥15.0时，控制培养温度为27.0
‑
34.5℃，所述菌种发酵液的溶氧为10
‑
40％。
[0007]不同的菌种在培养时溶氧和温度都会存在较大的差异，本申请试验的CRM197菌是好养菌，需要在适宜温度、有氧环境下培养。为此，本申请在发酵培养时，将种子罐的培养温
度控制在36.5℃、溶氧控制在＞40％，这是基于种子罐培养无需考虑CRM197菌是否表达分泌蛋白，其一定温度和氧容量范围内，温度和溶氧越高，菌种发酵效率越快，进而使菌种量能快速扩增。
[0008]本申请在生产罐培养时，生产罐在前期将培养温度控制在27.0
‑
37.5℃、溶氧控制在＞40％，在后期将培养温度控制在27.0
‑
34.5℃、溶氧控制在10
‑
40％。这是前期需要将菌种量扩增到一定数量，后期再控制菌种大量表达分泌CRM197蛋白。专利技术人经过研究实验发现，在控制菌种表达分泌蛋白时，溶氧不是越高越好，也不是越低越好，需要在不同生长阶段空置在不同的范围中才能较高地表达CRM197蛋白。溶氧过低，会影响CRM197菌种的生长繁殖速率；溶氧过高，CRM197菌种大量繁殖产生CRM197蛋白的同时，还会产生降解CRM197蛋白的物质，进而使CRM197蛋白的收获量降低。此外，降低培养温度、在不同生长阶段控制不同的溶氧能适当减缓菌种的繁殖而有促使菌种先生长表达分泌蛋白，从而达到较高产率的目的。由此，按照本申请的温度和溶氧控制方法，能够有效促使CRM197菌有效繁殖并表达分泌CRM197蛋白，提高CRM197蛋白的产量，能够较好地应用于CRM197蛋白的生产工艺中。
[0009]优选的，包括以下步骤：种子罐培养：将CRM197菌种液和液体培养基投入种子罐中混合为菌种培养液，在36.5
±
0.5℃的温度下培养至OD
600
值＞10.0收获种子罐菌液；当OD
600
值＜2.0时，控制所述菌种培养液的溶氧为45
‑
50％；当OD
600
值为2.0
‑
10.0时，控制所述菌种培养液的溶氧为55
‑
60％；生产罐培养：将所述种子罐菌液和液体培养基投入生产罐中混合为菌种发酵液，培养至OD
600
值＞40.0收获生产罐菌液；当OD
600
值＜15.0时，控制培养温度为27.0
‑
37.5℃，所述菌种发酵液的溶氧为55
‑
60％；当OD
600
值为15.0
‑
40.0时，控制培养温度为27.0
‑
34.5℃，所述菌种发酵液的溶氧为25
‑
30％；当OD
600
值＞40.0时，控制培养温度为27.0
‑
33.0℃，所述菌种发酵液的溶氧为12
‑
15％。
[0010]本申请在种子罐培养时，OD
600
值＜2.0时的菌种量相对较少，溶氧维持在45
‑
50％即可满足菌种的繁殖所需，待OD
600
值到达2.0
‑
10.0时，菌种量开始逐渐增加，此时将溶氧适当提升到55
‑
60％，由此不但能让菌种快速扩增到设定量，还能减少氧气供应所造成的能源浪费。
[0011]本申请在生产罐培养时，OD
600
值＜15.0时主要是为了菌种扩增，待OD
600
值维持在15.0
‑
40.0时主要是为了促进菌种表达分泌CRM197蛋白，此时培养温度和溶氧量不宜过低或过高，控制在27.0
‑
34.5℃的温度、25
‑
30％的溶氧下能使菌种在保证稳定生长的同时大量分泌的CRM197蛋白；OD
600
值＞40.0时，菌种发酵效率放缓，产蛋白能力下降，本申请将温度和溶氧进一步降低有效减缓菌种的代谢速率，进而减少菌种发酵液中的代谢产物量，使CRM197蛋白稳定存在于发酵菌液中，由此能收获高产量的CRM197蛋白。
[0012]优选的，在所述种子罐培养中，所述菌种培养液的溶氧采用如下步骤进行控制：
当OD
600
值＜2.0时，保持通气量为0.1
‑
0.3vvm，控制搅拌转速为200
‑
500rpm；当OD
600
值为2.0
‑
10.0时，保持通气量为0.1
‑
0.3vvm，控制搅拌转本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高CRM197蛋白产量的发酵培养方法，其特征在于，包括以下步骤：种子罐培养：将CRM197菌种液和液体培养基投入种子罐中混合为菌种培养液，在36.5
±
0.5℃的温度下培养至OD
600
值＞10.0收获种子罐菌液；所述菌种培养液在培养时，控制溶氧＞40%；生产罐培养：将所述种子罐菌液和液体培养基投入生产罐中混合为菌种发酵液，培养至OD
600
值＞40.0收获生产罐菌液；当OD
600
值＜15.0时，控制培养温度为27.0
‑
37.5℃，所述菌种发酵液的溶氧＞40%；当OD
600
值≥15.0时，控制培养温度为27.0
‑
34.5℃，所述菌种发酵液的溶氧为10
‑
40%。2.根据权利要求1所述的发酵培养方法，其特征在于，包括以下步骤：种子罐培养：将CRM197菌种液和液体培养基投入种子罐中混合为菌种培养液，在36.5
±
0.5℃的温度下培养至OD
600
值＞10.0收获种子罐菌液；当OD
600
值＜2.0时，控制所述菌种培养液的溶氧为45
‑
50%；当OD
600
值为2.0
‑
10.0时，控制所述菌种培养液的溶氧为55
‑
60%；生产罐培养：将所述种子罐菌液和液体培养基投入生产罐中混合为菌种发酵液，培养至OD
600
值＞40.0收获生产罐菌液；当OD
600
值＜15.0时，控制培养温度为27.0
‑
37.5℃，所述菌种发酵液的溶氧为55
‑
60%；当OD
600
值为15.0
‑
40.0时，控制培养温度为27.0
‑
34.5℃，所述菌种发酵液的溶氧为25
‑
30%；当OD
600
值＞40.0时，控制培养温度为27.0
‑
33.0℃，所述菌种发酵液的溶氧为12
‑
15%。3.根据权利要求1所述的发酵培养方法，其特征在于，在所述种子罐培养中，所述菌种培养液的溶氧采用如下步骤进行控制：当OD
600
值＜2.0时，保持通气量为0.1
‑
0.3vvm，控制搅拌转速为200
‑
500rpm；当OD
600
值为2.0
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：马伟，朱楠，
申请(专利权)人：艾美卫信生物药业浙江有限公司，
类型：发明
国别省市：