一种多糖基化诺卡沙星的制备方法技术

本发明专利技术属于生物合成领域，具体涉及种多糖基化诺卡沙星的制备方法。本发明专利技术发现获得一株可以产生多糖基化诺卡沙星衍生物的菌株Actinokineospora fastidiosa JCM 3276。多糖基化诺卡沙星与诺卡沙星的抗菌活性相近，但稳定性更佳。因此，本发明专利技术公开了一种成药性好的诺卡沙星衍生物及其产生菌株。诺卡沙星衍生物及其产生菌株。诺卡沙星衍生物及其产生菌株。

【技术实现步骤摘要】
一种多糖基化诺卡沙星的制备方法


[0001]本专利技术属于生物合成领域，具体涉及种多糖基化诺卡沙星的制备方法。

技术介绍
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[0002]硫肽类抗生素是一类核糖体合成和翻译后修饰的肽(RiPP)天然产物，对革兰氏阳性病原体的各种耐药菌株具有很高的致死率。如：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和耐万古霉素屎肠球菌(VRE)等耐药菌均有良好作用。目前，已发现的硫肽类化合物超过200个，根据结构中核心氮的氧化状态不同，将其划分为a、b、c、d和e五个系列，而诺卡沙星属于其中氧化程度最高的e型中的代表。(VinogradovAA,Suga H.Introduction to Thiopeptides:Biological Activity,Biosynthesis,and Strategies for Functional Reprogramming.Cell Chem Biol.2020Aug 20；27(8):1032
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1051.doi:10.1016/j.chembiol.2020.07.003.Epub 2020Jul 21.PMID:32698017.)硫肽类抗生素作为一种生物多肽，其具有多肽类物质良好的活性、独特的机制。例如，诺卡沙星抗耐药菌的机制与鸟苷三磷酸酶相关中心(GAC)密切相关(Clementi和Polacek,2010)。硫肽类抗生素GAC结合位点与临床使用的抗生素多有不同(Polikanov等人，2018年)，这也有助于我们理解硫肽类抗生素抗耐药菌的关键。在翻译过程中，GAC结合延伸因子，从而触发它们的GTPase活性，而这对于结合到新生肽链的tRNA的易位是不可或缺的。对于硫链肽和诺西肽，空间结合阻断GAC并阻止转译因子与核糖体的联系，从而导致蛋白质合成抑制(Cameron等人，2002；Harms等人，2008年；Walter等人，2012)进而达到强大的杀菌效果。
[0003]现有诺卡沙星是硫肽环素中具有新颖靶点、高度抗菌活性的一种抗生素。它作用于细菌核糖体50S大亚基中的23S rRNA和L11蛋白形成复合物，从而抑制L11蛋白构象的转变，细菌蛋白质合成过程中的肽链转座被影响，使细菌无法合成蛋白质，导致菌体死亡，进而达到杀菌的效果。目前，尚无针对该靶点和机制的抗生素成药。另外，其能够在极低浓度下(ng/mL)能杀死G
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敏感菌和耐药菌株，抗菌效果优于绝大多数已报道的抗生素(Naidu BN,et al.Bioorg.Med.Chem.Lett.,2004,14:5573；LingLL,et al.Nature,2015,517:455)。也正因为其新颖性与高效性，美国百时美施贵宝公司和默克公司等多家制药企业对其进行了长达几十年的研究，希望通过化学或生物转化法对硫肽环素结构进行多样化修饰以期解决其水溶性问题(Pucci MJ,etal.Antimicrob.Agents Chemother.,2004,48:3697；Naidu BN,etal.Bioorg.Med.Chem.Lett.,2004,14:3743；Naidu BN,et al.Bioorg.Med.Chem.Lett.,2005,15:2069)但最终仅能够改善其水溶性，结构稳定性问题没有得到良好的解决优化方案，最终导致其成药性不足，投入难以得到转化，没有完成对于诺卡沙星的结构优化。
[0004]文献(Yousefet al.Discovery andbiosynthesis ofpersiathiacins:Unusual polyglycosylated thiopeptides active against multi
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drug resistant tuberculosis.bioRxiv 2021.10.24.465558；doi:https://doi.org/10.1101/2021.10.24.465558)报道了一种新型多糖基化诺卡沙星具有下式(I)结构：
[0005][0006]该化合物实际上诺卡沙星母核被单糖和多糖取代形成化合物，但由于存在空间位阻，难以化学方法合成，阻碍该化合物的开发和应用。

技术实现思路
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[0007]本专利技术的目的是提供一种多糖基化诺卡沙星的新的制备方法，其通过微生物发酵制备获得。具体由菌株Actinokineosporafastidiosa JCM 3276发酵产生化合物I。
[0008]所述的培养基为Nos发酵培养基，SM20，SM1、Noc可溶培养基或SM5。
[0009]本专利技术首次发现Actinokineosporafastidiosa JCM 3276是能够稳定、高效地产生多糖基化诺卡沙星(I)，进一步优化现有发酵条件，促进诺卡沙星成药。
[0010]有益效果：
[0011]1、本专利技术首次发现Actinokineospora fastidiosa JCM 3276不需要添加诺卡沙星原料，只需要采用特定的培养基发酵就可以获得多糖基化诺卡沙星(I)。该菌株属于放线动孢菌属，革兰氏阳性，在发酵培养基中生长迅速，发酵周期短，未见有关诺卡沙星被该菌株获得的文献报道。所述的多糖基化诺卡沙星(I)，其抗菌活性与诺卡沙星相当，均对革兰氏阳性菌有较好的抑菌活性，通过响应面法对发酵条件的优化后，显著提高了糖基化诺卡沙星的产量，为进一步工业化生产及临床成药提供了可行性。
附图说明：
[0012]图1：多糖基化诺卡沙星(I)与原诺卡沙星的稳定性比较数据；
[0013]图2：不同培养基中发酵产物的液相(A)、M+Na质谱(B)和M
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H质谱氢(C)；
[0014]图3：原诺卡沙星(A)与多糖基化诺卡沙星(I)(B)的紫外吸收对比图谱；
[0015]图4：多糖基化诺卡沙星(I)结构鉴定相关图谱，A为氢谱，B为碳谱，C为HMBC，D、HSQC，E为为COSY谱。
具体实施方式
[0016]以下进一步提供实施实例，这些实施实例有助于理解本专利技术，仅用作说明而不限制本菌株Actinokineospora fastidiosa JCM 3276购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)。
[0017]实施例1对于筛选得到目标菌株的产物验证与评测
[0018]菌株进行发酵、产物测定、产物纯化、结构鉴定、生物活性测定。经过一系列步骤，最终完成对于所选菌株合成诺卡沙星衍生物的能力验证与评价工作。
[0019]1、菌株的发酵
[0020]将菌种从斜面转接至发酵培养基，30度振摇培养3天。种子液按照2％的接种量(v/v)转接至发酵培养基，30度振摇培养7天。取1ml发酵液置于离心管中，加入等体积的乙酸乙酯振荡均匀，12 000rpm离心10min。取5ml上层清液,减压干燥，用200μl DMSO溶解,0.22μ本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多糖基化诺卡沙星的制备方法，其特征在于新型多糖基化诺卡沙星具有下式(I)结构：由菌株Actinokineospora fastidiosa JCM ...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴旭日，曹玉丹，吴羚锐，陈宁静，徐允聪，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：